Chk1抑制剂对小细胞肺癌的抑瘤作用及继发性耐药的机制研究

发布时间：2020-07-31 16:45

【摘要】：背景及目的:小细胞肺癌约占全体肺癌的20%,是恶性程度最高,预后最差的恶性肿瘤之一,五年生存率低于5%。小细胞肺癌无明确的靶向驱动基因,易复发,预后差。细胞周期检测点激酶1(Chk1)会使化疗药物作用下DNA损伤的肿瘤细胞周期停滞,并促进DNA同源重组及损伤修复,被认为是化疗耐药的主要原因之一。Chk1抑制剂消除S期内检测点监测,可以造成复制灾难促进细胞凋亡;抑制消除DNA毒性药物造成细胞周期阻滞,促使细胞携带受损DNA进入有丝分裂期,造成有丝分裂灾难促使细胞死亡,Chk1抑制剂在某些实体肿瘤的临床实验中也表现出一定的对肿瘤的抑制作用,但Chk1抑制剂对小细胞肺癌的作用效果仍不清楚,作用机制仍不明确。是否与顺铂有协同作用,对顺铂耐药的小细胞肺癌是否有逆转效果同样需要研究,我们希望在临床病例分析、细胞分子水平及动物模型三方面探讨Chk1抑制剂对小细胞肺癌的抑瘤作用和促凋亡机制。同时,限制Chk1抑制剂的临床应用主要由于药物的毒副作用、耐受性和药物的继发性耐药,我们希望通过构建Chk1抑制剂继发性耐药小细胞肺癌细胞系,研究继发性耐药中的细胞特性和耐药水平的调控机制,筛选耐药热点蛋白和可能性致耐药的信号通路,为小细胞肺癌的治疗提供潜在的新靶点,并深入了解耐药调控机制为耐药逆转提供新的思路和策略。方法:应用细胞周期检测点激酶1抑制剂prexasertib(LY2606368)及联合顺铂对不同P53及Rb基因状态的小细胞肺癌细胞系的抑瘤效果进行研究,应用CellTitle Glo检测细胞存活率,同时通过流式细胞术、蛋白印迹法对小细胞肺癌细胞内各细胞周期影响及Caspase依赖性细胞凋亡通路的蛋白变化进行研究,同时以siRNA调减,慢病毒转染调高关键蛋白验证,通过siRNA调减、质粒转染调高E2F1表达,qRT-PCR及蛋白印迹验证E2F1在Chk1抑制剂抑瘤作用中所起作用。建立顺铂继发耐药细胞系,了解通过裸鼠异种肿瘤原位种植技术验证细胞周期检测点激酶1及其联合顺铂时对小细胞肺癌细胞系及顺铂耐药细胞系的抑瘤作用。建立Chk1抑制剂继发性耐药小细胞肺癌细胞系,应用反向蛋白序列分析(RPPA)对比亲代系筛选热点靶向蛋白,对建立的Chk1抑制剂继发性耐药的小细胞肺癌细胞系通过siRNA调减,电转染亲代系调高相应RPPA筛选的热点蛋白,应用CellTitleGlo,蛋白印迹,qRT-PCR观察对Chk1抑制剂耐药能力的变化及相关凋亡蛋白和细胞周期调控蛋白的变化情况,对继发性耐药细胞系进行单细胞克隆培养,应用用CellTitleGlo,蛋白印迹,qRT-PCR应用对单克隆观察Wee1基因拷贝数变化,mRNA水平,蛋白水平表达与耐药水平的相关性。通过免疫组化,组织芯片对手术切除小细胞肺癌Wee1、Chk1表达水平及与预后相关性分析。结果:Chk1抑制剂可以在不同p53基因状态的小细胞肺癌细胞系中观察到明显的抑瘤效果,同时和顺铂有明显的协同效应。Chk1抑制剂可以消除顺铂处理后造成的G1/S及G2/M期细胞周期阻滞,细胞凋亡明显增加,DNA损伤标志物γH2AX,DNA损伤修复标志物Cleaved PARP明显增加,细胞周期进入有丝分裂期的标志物pHH3均明显增高。Western Blot显示单独应用Chk1抑制剂或siChk1处理或联合应用顺铂后对小细胞肺癌细胞系的协同抑瘤作用,这种抑瘤作用主要通过激活Caspase为主导的细胞凋亡通路并下调E2F1表达形成的。动物实验验证Chk1抑制剂对小细胞肺癌有抑瘤作用,同顺铂有协同作用,并能逆转顺铂耐药,Wee1的表达水平与Chk1继发性耐药水平显著相关,siRNA调减Wee1或应用Wee1抑制剂可以逆转耐药,消除G2/M期阻滞,增加细胞凋亡。亲代系质粒转染后可以获得耐药能力,同时对Wee1调控的下游蛋白和激酶CDK1及CDC25C应用相应的siRNA调减后均会使亲代系获得耐药能力。单细胞克隆实验提示Wee1 DNA拷贝数、mRNA相对水平及蛋白表达水平与继发耐药水平呈显著正相关。RPPA筛选出耐药系中表达调高的蛋白主要集中在细胞凋亡和增殖,细胞周期调控相关蛋白上,其中p38MAPK在应用药物处理后其磷酸化蛋白增高7倍以上,siRNA或小分子抑制剂调低p38MAPK表达可以逆转Chk1抑制剂继发性耐药小细胞肺癌细胞系的耐药性。TMA结果提示小细胞患者中Chk1与E2F1及Wee1表达呈正相关,Wee1表达与小细胞肺癌患者预后呈正相关,Chk1表达与预后呈负相关。结论:Chk1抑制剂在体内和体外实验中均表现出对小细胞肺癌特别是p53突变的小细胞肺癌明确的抑瘤作用,Chk1抑制剂与顺铂等化疗毒性药物有协同抑瘤作用。Chk1抑制剂可以逆转小细胞肺癌的继发性耐药。Ch1抑制剂主要通过Caspase通路和下调E2F1促进肿瘤细胞凋亡。Wee1过表达在Chk1抑制剂继发耐药中起重要作用,Wee1DNA拷贝数、mRNA水平及蛋白水平与继发耐药能力显著相关。p38MAPK信号通路旁路激活也可能在Chk1抑制剂继发性耐药的形成机制中起到一定的作用。Chk1和Wee1可以成为小细胞肺癌预后生存的预测因子之一。Chk1抑制剂与Wee1抑制剂联合应用有可能为小细胞肺癌的治疗提供新的治疗靶点和治疗策略。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

顺铂,性作用,小细胞肺癌,细胞活力

28图 1. 抑制 Chk1 可以增强小细胞肺癌中顺铂介导的肿瘤细胞毒性作用并活化 Caspase-2/3(A-B) 细胞活力实验：人类小细胞肺癌细胞系在不同试剂处理 72 小时后的肿瘤细胞存活率(A) 1 M 顺铂, 300nM AZD7762, 及两种药物联合应用(B) 1 M 顺铂, 30nM Chk1 抑制剂

顺铂,应用效果,抑制剂,转染

天津医科大学博士学位论文一 Chk1 抑制剂对小细胞肺癌的抑瘤作用prexasertib 及两种药物联合应用(C) 细胞活力实验：检测小细胞肺癌细胞系 GLC4 转染下列 siRNA：空白 siRNA(siControl), Chk1 (siCHK1), 和/或 Chk2 (siCHK2), 联合或不联合顺铂 (2.5 M) 处理 72 小时后 (D) 细胞活力实验：在顺铂存在的情况下，检测 p53 基因突变型或 p53 基因野生型小细胞肺癌细胞分别转染 siControl 或 siCHK1 的细胞存活率；蛋白质印迹法检测(E) Chk1, Chk2, cleaved caspase 3 活化片段, (F) GLC4 小细胞肺癌细胞系联合或不联合顺铂，同时应用 siRNA 转染后的凋亡相关蛋白的水平。以 -tubulin 作为内参蛋白。非配对双截尾 t 检验 p 值: *p<0.05; **p<0.005; ns:无显著性差别。

柱状图,顺铂,碎片化,细胞生存

天津医科大学博士学位论文一 Chk1 抑制剂对小细胞肺癌的抑瘤作用小时给药，随后第 24th小时加入顺铂; cisplatin followed by AZD: 顺铂在第 0th小时给药，随后 AZD7762 在第 24th小时加入. (B) 柱状图显示在下列相应处理 96 小时后细胞存活率的变化情况（倍数变化），相同实验重复 3 次，所有数据表示为中位数标准差。

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