miR-200a在前列腺癌进展及转移中的作用及机制研究

发布时间：2020-08-01 15:26

【摘要】：前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤,随着人口老龄化的加剧,前列腺癌的发病率和死亡率也逐年增高。前列腺癌易发生转移,且转移后预后较差。在治疗方面,早期前列腺癌主要以手术治疗为主,若手术治疗后复发或前列腺癌发生转移,则以内分泌治疗为主。有研究表明早期雄激素剥夺治疗对80%的患者敏感,此时大多为激素依赖性前列腺癌(androgen-dependent prostate cancer,ADPC),在经过14-30个月的中位时间后,最终都发展为去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC),此阶段的前列腺癌对各种治疗都不敏感,是晚期患者死亡的主要原因。现已有很多关于前列腺癌发生发展及转移方面的研究,但其原因及机制目前仍未完全了解清楚。近年来,越来越多关于microRNA(miRNA)和肿瘤之间相关性的研究。miRNA是单链的非编码小分子RNA,含有19-25个核苷酸,通过结合编码基因的mRNA的3’非编码区(3’UTR)在转录后水平抑制靶基因表达,已有大量的研究表明miRNA和细胞的增殖、凋亡有着密不可分的关系。通过结合基因芯片技术、生物信息学技术和临床相关性研究分析,我们发现miR-200a在ADPC和CRPC组织中的表达存在差异,CRPC组织中miR-200a相对ADPC组织显著低表达。miR-200a是miR-200家族中的一员,在许多肿瘤中都发现miR-200a表达异常,但是miR-200a与前列腺癌关系的研究目前仅国外有少数报道,故本研究首先通过实时荧光定量PCR技术在前列腺癌的组织中验证miR-200a的表达水平,并且通过miR-200a表达失调的体外功能实验,探究miR-200a在前列腺癌中的生物学功能。最后通过Agilent(人类)表达谱芯片检测和预测网站相结合的办法进一步探究miR-200a潜在的下游靶基因并进行验证,为筛选前列腺癌的生物标志物以及今后寻找新的前列腺癌治疗靶点奠定坚实的理论基础。第一部分miR 200a在前列腺癌组织中的表达差异目的:前列腺癌的发生是一个很复杂的过程,涉及到许多不同的基因。为了寻找可能影响前列腺癌发生发展的miRNA,本阶段研究通过miRNAs芯片表达谱检测分析在ADPC患者组织标本与CRPC癌患者组织标本中显著差异性表达的miRNA,结合文献选取有研究意义的miRNA,并予以验证。方法:临床收集8例ADPC组织与6例CRPC组织在液氮中保存,取3例ADPC组织与3例CRPC组织进行miRNAs表达谱芯片检测分析,结合文献寻找有研究意义的miRNA,并且进行实时荧光定量PCR(q RT-PCR)实验,在组织标本中验证其表达量。同时,下载美国纪念斯隆凯瑟琳癌症研究中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center,MSKCC)数据库中前列腺癌患者的miRNA表达基因芯片数据,利用统计学的方法分析差异表达的miRNA在前列腺癌中的诊断作用以及与前列腺癌生化复发的关系。结果:miRNA表达谱芯片检测分析发现在ADPC与CRPC组织中miR-200a的表达存在显著差异。miR-200a在恶性程度较高的CRPC组织中与ADPC组织相比显著低表达,并且在前列腺癌组织标本中进行q RT-PCR实验同样验证了这一点(P0.001)。同时,对MSKCC数据库中下载的前列腺癌患者资料进行二次分析,以中位数为截点将前列腺癌组分为miR-200a高表达组和miR-200a低表达组进行Kaplan Meier分析,结果显示miR-200a低表达组的患者生化复发时间似乎比miR-200a高表达组短,但是无统计学差异(P0.05)。通过多因素COX回归分析得出miR-200a是影响前列腺癌患者预后的独立危险因素。结论:通过研究结果我们发现miR-200a在CRPC中的表达较ADPC中显著降低,并且miR-200a能够用于辅助诊断前列腺癌的恶性进展。第二部分miR 200a对前列腺癌细胞生物学功能的影响及机制初探目的:在第一部分中,我们通过miRNA芯片表达谱分析结合q RT-PCR验证了miR-200a在CRPC组织中显著低表达,并且miR-200a是影响前列腺癌患者预后的独立危险因素。为了进一步探究miR-200a可能对前列腺癌细胞的生物学功能造成哪些影响以及产生影响的机制,本部分研究采用过表达前列腺癌细胞中miR-200a的方法,进行凋亡、侵袭、迁移和平板细胞克隆形成等实验,研究分析miR-200a对前列腺癌细胞生物学功能的影响并寻找miR-200a的下游靶基因,进一步了解miR-200a和前列腺癌之间的关系。方法:分别在两种雄激素非依赖性前列腺癌细胞(DU145、PC3)中过表达miR-200a,将过表达组与阴性对照组进行MTT实验和低密度细胞集落形成实验实验,观察miR-200a对前列腺癌细胞增殖的影响;Transwell小室侵袭和迁移实验观察miR-200a对前列腺癌细胞侵袭和迁移的影响;进行凋亡实验并使用流式细胞技术检测凋亡率,观察miR-200a对前列腺癌细胞凋亡的影响。使用Agilent(人类)表达谱芯片检测和miRNA靶基因分析和预测软件(miRNADA、Target Scan、Array、Diana)筛选miR-200a的潜在下游靶基因,并通过Western Blot实验和双荧光素酶报告基因实验来验证。结果通过SPSS20.0统计软件分析处理。P0.05为差异有统计学意义。结果:MTT细胞增殖实验和低密度细胞集落形成实验均表明过表达miR-200a组细胞和阴性对照组(negative control组)相比,过表达组能够显著抑制前列腺癌细胞的增殖能力(P0.05);Transwell小室实验表明过表达miR-200a后前列腺癌细胞的侵袭和迁移能力明显降低(P0.05);使用流式细胞仪进行凋亡检测发现过表达miR-200a后能增加前列腺癌细胞的凋亡率(P0.05)。通过Agilent(人类)表达谱芯片检测和miRNA靶基因分析和预测软件结合的方法,我们发现溴样结构域蛋白4(BRD4)是miR-200a的潜在下游靶基因,并且Western Blot实验和荧光素酶报告基因实验证实了miR-200a可以结合到BRD4的3’UTR区使得BRD4蛋白的表达量下降(P0.05)。结论:试验证明了过表达miR-200a后,前列腺癌细胞的侵袭、迁移及增殖能力均受到抑制,并能促进前列腺癌细胞凋亡,故能得出结论,miR-200a在前列腺癌发生发展中扮演的是抑癌基因的角色,并且BRD4是miR-200a的潜在下游靶基因,miR-200a可能通过靶向BRD4来影响前列腺癌细胞的生物功能。
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.25
【图文】：

表格表示,差异表达

图 1.1 excel 表格表示 miRNA 在 ADPC 组织和 CRPC 组织中的差异表达随机选取液氮中保存的 3 例 ADPC 组织和 3 例 CRPC 组织，采用 AgilentmiRNAs 表达谱芯片，委托上海吉凯生物公司进行实验操作和数据分析。检测结果显示 miR-200a 在 CRPC 中与 ADPC 相比明显降低。2.miR-200a 与前列腺癌患者生化复发时间的关系

生化,患者,表格表示,前列腺癌

表明 miR-200a 在 CRPC 组织中的表达低于与 A 1.1 excel 表格表示 miRNA 在 ADPC 组织和 CRPC 组织中的差异取液氮中保存的 3 例 ADPC 组织和 3 例 CRPC 组织，谱芯片，委托上海吉凯生物公司进行实验操作和数据200a 在 CRPC 中与 ADPC 相比明显降低。a 与前列腺癌患者生化复发时间的关系

前列腺癌,荧光定量PCR,标本,抑癌基因

T-PCR 验证 miR-200a 在 ADPC 组织和 CRPC 组织中将剩余的前列腺癌标本进行荧光定量 PCR 组织中的表达和 ADPC 中相比明显降低，中扮演的是抑癌基因的角色（P < 0.001）。

【参考文献】