自噬在顺铂诱导食管癌细胞凋亡中的作用及机制研究

发布时间：2020-08-09 10:02

【摘要】：目的食管癌是全球范围内常见的消化道肿瘤,在我国恶性肿瘤死亡率中排第4位,在全球恶性肿瘤死亡率位列第6,外科手术是治疗可切除食管癌首选的方法,但术后局部复发率高达40%-60%,而接近50%的食管癌患者确诊的时候已有远处转移,失去了手术切除的机会,这些患者只能依赖于化学治疗和放射治疗,顺铂作为食管癌化疗的一线药物,对于食管癌的治疗效果显著。顺铂作为细胞毒性药物杀死肿瘤细胞的机制主要是损伤和抑制DNA的合成。在此过程中激活了多种信号途径(主要为凋亡途径),从而避免或促进细胞的死亡。近年来,大量研究表明,自噬作为另一种细胞死亡形式,可单独或与凋亡共同作用参与化疗药物对肿瘤细胞的影响。本实验目的是验证顺铂是否诱导食管癌EC109细胞的自噬,并进一步探究自噬在顺铂诱导食管癌细胞损伤中的作用,以及其发生作用的具体机制。方法(1)研究对象:体外培养人食管鳞癌EC109细胞株,使用不同浓度的顺铂处理EC109细胞不同的时间点,浓度梯度为1u M、2.5u M、5u M、7.5u M、10u M,每个浓度设0h、12h、24h、48h、72h五个时间点。用CCK-8法检测细胞活力,计算出IC50剂量并确定下一步顺铂干预的浓度及作用的时间。(2)顺铂干预浓度和时间点的选取与分组:根据CCK-8检测结果,选取5umol/L顺铂,建立不同时间点顺铂处理模型,设正常对照组(NC)、顺铂处理24h组、顺铂处理48h组、顺铂处理72h组。建立不同浓度顺铂处理72小时模型,设正常对照组(NC)、顺铂浓度1u M组、顺铂浓度2.5u M组、顺铂浓度5u M组。检测指标:通过免疫印迹法检测各组EC109细胞自噬标记蛋白LC3-II和Beclin1的表达水平、自噬底物蛋白p62及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、XIAP的表达水平;免疫荧光检测各组EC109细胞自噬标记蛋白LC3的表达;TUNEL法检测各组EC109细胞的凋亡率。(3)药物干预与分组:给予自噬抑制剂氯喹干预EC109细胞,设正常对照组、氯喹处理组、顺铂处理组、顺铂+氯喹干预组。选取EC109细胞自噬及凋亡表达最明显的顺铂处理时间点和浓度进行处理,即5u M顺铂,处理72h。氯喹预处理方法:氯喹稀释液在顺铂处理前给予预处理2h。检测指标:免疫印迹技术检测各组EC109细胞自噬标记蛋白LC3-II、凋亡相关蛋白cleaved caspase-3及XIAP蛋白的表达变化;TUNEL法检测各组EC109细胞的凋亡率。(4)Si RNA转染与分组:给予Si RNA干预Atg5的表达,设正常对照组、Si RNAAtg5干预组、顺铂处理组、顺铂+Si RNAAtg5干预组。选取EC109细胞自噬及凋亡表达最明显的顺铂处理时间点和浓度进行处理,即5u M顺铂,处理72h。Si RNAAtg5预处理方法:Si RNAAtg5在顺铂处理前给予转染处理6h。检测指标:免疫印迹技术检测各组EC109细胞Atg5、LC3-II、cleaved-caspase-3、及XIAP蛋白的表达水平;TUNEL法检测各组EC109细胞的凋亡率。结果(1)CCK-8结果显示,EC109细胞对顺铂的作用敏感,顺铂对EC109细胞增殖的抑制作用呈剂量浓度效应。随着时间及浓度的增加,细胞增殖的抑制作用明显增加(P0.05)。5u M顺铂处理组,细胞增殖抑制率在所有12h、24h、48h、72h均小于50%。(2)顺铂处理不同时间点EC109细胞自噬的检测:免疫印迹结果示:顺铂处理组自噬标记蛋白自噬标记蛋白LC3-II、Beclin1表达明显增多,5u M顺铂处理72h组表达最多,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05);自噬底物蛋白p62表达明显减少,且随着药物浓度的增加及作用时间的延长表达逐渐减少,5u M顺铂处理72h组表达最少,其差异具有统计学意义(P0.05)。免疫荧光结果示:随着顺铂浓度的增加及作用时间的延长,EC109细胞LC3-II绿色荧光点增加,5u M顺铂处理72h组表达最高,其差异具有统计学意义(P0.05)。(3)顺铂处理不同时间点EC109细胞凋亡及XIAP表达的检测:免疫印迹结果示:随着顺铂浓度的增加及作用时间的延长,EC109细胞cleaved caspase-3表达逐渐增多,5u M顺铂处理72h组表达最多,差异具有统计学意义(P0.05);EC109细胞XIAP表达逐渐减少,5u M顺铂处理72h组表达最少,与正常对照组相比,其差异具有统计学意义(P0.05)。TUNEL结果示:随着顺铂浓度的增加及作用时间的延长,EC109细胞凋亡阳性点表达逐渐增多5u M顺铂处理72h组表达最多,差异具有统计学意义(P0.05)。(4)氯喹干预对EC109细胞自噬及凋亡的影响:免疫印迹结果示:与NC组相比,顺铂组LC3-II表达增多(P0.05),顺铂+氯喹组LC3-II表达较顺铂组明显增多(P0.05);与NC组相比,顺铂组cleaved caspase-3表达增多,顺铂+氯喹组cleaved caspase-3表达较顺铂组明显减少(P0.05)。TUNEL结果示:与NC组相比,顺铂组EC109细胞凋亡阳性点表达增多(P0.05),顺铂+氯喹组细胞凋亡阳性点表达较顺铂组明显减少(P0.05)。(5)Si RNA干预EC109细胞自噬及凋亡的影响:免疫印迹结果示:与NC组相比,顺铂组LC3-II和cleaved caspase-3表达增多(P0.05),顺铂+Si RNA组LC3-II和cleaved caspase-3表达较顺铂组明显减少(P0.05)。TUNEL结果示:与NC组相比,顺铂组EC109细胞凋亡阳性点表达增多(P0.05),顺铂+Si RNA组细胞凋亡阳性点表达较顺铂组明显减少(P0.05)。(6)干预自噬对XIAP表达的影响:免疫印迹结果示:与NC组相比,顺铂组EC109细胞XIAP表达减少(P0.05);与顺铂组相比,顺铂+氯喹组和顺铂+Si RNA组XIAP表达增多(P0.05)。结论本研究证实:(1)顺铂处理后EC109细胞凋亡增多,并且伴随着自噬的激活以及XIAP表达减少;(2)氯喹抑制自噬以及Si RNA Atg5干预自噬后,给予顺铂处理,凋亡相关蛋白cleaved caspase3表达减少,细胞凋亡率减低;(3)氯喹抑制自噬以及Si RNA Atg5干预自噬后,XIAP表达增多。综上所述,得出结论:(1)顺铂诱导食管癌细胞自噬的激活;(2)自噬激活加重了顺铂所致食管癌细胞损伤;(3)自噬可能是通过过度清除XIAP而加重食管癌细胞的凋亡。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1
【图文】：

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图 2.1：不同浓度顺铂作用不同时间对 EC109 细胞的活性的影响时间和不同浓度顺铂处理 EC109 细胞自噬、凋亡的检测迹技术检测顺铂处理后不同时间点和不同浓度 EC109 细胞中疫印迹技术检测顺铂处理 0h、24h、48h、72h 四个时间点和 0M、5uM 四个浓度梯度内自噬相关蛋白 LC3-II 的表达结果显示比，顺铂处理组 LC3-II 的表达明显增多，且随着药物作用时间的表达也逐渐增多。5uM 顺铂处理 72h 表达最多。差异具有统计5）。见图 2.2A、2.2B、2.2C、2.2D。

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5uM 浓度顺铂处理不同时间点 LC3-II 蛋白表达影响的统（*P<0.05；**P<0.01）图 2.2C：不同浓度顺铂处理 72h LC3-II 蛋白表：NC：正常对照组；uM：不同浓度顺铂处理 72h 组。GA

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科大学硕士学位论文二、结图 2.2A：5uM 浓度顺铂处理不同时间点 LC3-II 蛋白表达的影响注：NC：正常对照组；24h、48h、72h：5uM 顺铂不同处理时间组。GAPDH：内图 2.2B：5uM 浓度顺铂处理不同时间点 LC3-II 蛋白表达影响的统计分析（*P<0.05；**P<0.01）

【参考文献】