外泌体介导的miR-9-5p抑制肾癌细胞增殖和转移及其相关机制的探索

发布时间：2020-08-10 17:06

【摘要】：目的:1.筛选肾透明细胞癌中差异表达的miRNA,验证miR-9-5p在肾透明细胞癌中低表达并鉴定其临床价值。2.探索miR-9-5p对体外肾癌细胞生物学特性的影响。3.预测miR-9-5p的作用靶点并初步探索其相关机制。4.探索miR-9-5p在肾透明细胞癌患者血清外泌体中的表达情况。方法:1.通过查阅文献并筛选肾透明细胞癌中表达差异的miRNA,运用荧光qR T-PCR测定miR-9-5p在44对肾透明细胞癌组织及其癌旁组织、肾透明细胞癌细胞系786-O和SN12-PM6中的表达情况,应用统计学分析其临床意义。2.构建对照质粒pFlag-cmv2及miR-9-5p表达质粒phsa-miR-9,分别转染786-O和SN12-PM6细胞,构建高表达miR-9-5p的肾癌细胞模型,并通过qR TPCR分析其转染后的表达情况。3.采用CCK8、transwell实验分析miR-9-5p上调后786-O细胞在增殖、侵袭和转移能力上的变化。4.通过Targetscan等多个靶点预测软件筛选miR-9-5p的靶点,预测其靶基因,应用qR T-PCR、Western blot技术检测所预测靶基因在肾透明细胞癌组织及其癌旁组织、转染后的786-O和SN12-PM6细胞中的表达情况。5.通过超速离心法分离4例肾透明细胞癌患者和4例健康对照者的血清外泌体并以透射电子显微镜观察,采用HiSeq深度测序检测和分析外泌体中的miRNA表达谱,运用生物信息技术分析miRNA表达谱。6.采用荧光q RT-PCR测定10例肾透明细胞癌患者和4例健康对照者的血清外泌体中miR-9-5p的表达情况。结果:1.根据文献报道,高通量microarray分析肾透明细胞癌及其癌旁组织的miRNA表达谱结果显示癌组织中miR-9-5p的表达下调7.6倍,且miR-9-5p在多种肿瘤中表达下调并具有一定的抑癌作用;qRT-PCR结果显示miR-9-5p在93.2%(41/44)的肾透明细胞癌中明显下调(p=0.00010.05),平均下调3.8倍,相对于癌旁正常组织,786-O和SN12-PM6细胞miR-9-5p的表达分别下调836.3倍和24.1倍;miR-9-5p的表达水平与肾透明细胞癌患者的性别、年龄、肿瘤分期、分级、大小均无统计学相关性。2.转染phsa-miR-9后的786-O和SN12-PM6细胞miR-9-5p的表达显著提高,分别为21610.3倍和4599.5倍。3.上调miR-9-5p的表达后,786-O细胞的增殖、侵袭和转移能力明显受到抑制。4.靶点预测软件显示CXCR4、NFκB1、FN1、Bcl-2的3’UTR上均分别有miR-9-5p种子序列的结合位点,四者在肾透明细胞癌组织中的mR NA表达水平升高,分别为癌旁组织的71倍、5.8倍、19.3倍和9.7倍,对应的蛋白水平表达也升高;CXCR4在高表达miR-9-5p的786-O和SN12-PM6细胞中表达下调明显。5.4例肾透明细胞癌患者和4例健康对照者的血清外泌体测序结果显示miR-9-5p在肾透明细胞癌患者血清外泌体中表达上调。6.10例肾透明细胞癌患者和4例健康对照者的血清外泌体的qR T-PCR结果显示miR-9-5p在肾透明细胞癌患者血清外泌体中表达上调。结论:miR-9-5p在肾透明细胞癌中表达下调,其通过抑制肾癌细胞的增殖和转移发挥抑癌基因的作用;CXCR4可能是miR-9-5p发挥功能的直接作用靶点,其在肾透明细胞癌组织中高表达可能是由于miR-9-5p的下调所致;肾透明细胞癌可能通过外泌体介导排出具有抑癌作用的miR-9-5p。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.11
【图文】：

肾透明细胞癌,癌组织,患者,表达谱

1644例中有41例癌组织表达低于癌旁正常组织，占93.2%（41/44），平均下调3.8倍。（图1）相对于癌旁正常组织，786-O和SN12-PM6细胞miR-9-5p的表达分别下调836.3倍和24.1倍。（图2）miRNA P-value Fold-changehsa-miR-141 4.11E-08 103.9907hsa-miR-200c 4.35E-06 99.78783hsa-miR-138 1.14E-06 22.829311hsa-miR-514 5.95E-04 18.36648hsa-miR-135a 0.037347153 13.173383hsa-miR-509-3p 3.74E-04 8.679166hsa-miR-9* 9.41E-04 8.520466hsa-miR-508-3p 0.003473291 7.8097095hsa-miR-124 0.004608731 7.624603hsa-miR-9 0.014416155 7.6159034表 1：文献报道高通量microarray分析5对肾透明细胞癌及其癌旁组织的miRNA表达谱结果：癌组织中miR-9-5p表达下调7.6倍[18]。Table 1：Downregulation profle of miRNAs in 5 pairs of ccRCC and adjacent normaltissues，miR-9-5p was one of the remarkably downregulated miRNAs (7.6-fold)[18]图 1：44对肾透明细胞癌患者的癌组织及其癌旁正常组织miR-9-5p的相对表达情况Fig 1: Expression of miR-9-5p in 44 pairs of ccRCC specimens and adjacent normaltissues（***P＜0.001）

肾透明细胞癌,癌组织,患者,细胞的

44例中有41例癌组织表达低于癌旁正常组织，占93.2%（41/44），平均下调3.8倍。（图1）相对于癌旁正常组织，786-O和SN12-PM6细胞miR-9-5p的表达分别下调836.3倍和24.1倍。（图2）miRNA P-value Fold-changehsa-miR-141 4.11E-08 103.9907hsa-miR-200c 4.35E-06 99.78783hsa-miR-138 1.14E-06 22.829311hsa-miR-514 5.95E-04 18.36648hsa-miR-135a 0.037347153 13.173383hsa-miR-509-3p 3.74E-04 8.679166hsa-miR-9* 9.41E-04 8.520466hsa-miR-508-3p 0.003473291 7.8097095hsa-miR-124 0.004608731 7.624603hsa-miR-9 0.014416155 7.6159034表 1：文献报道高通量microarray分析5对肾透明细胞癌及其癌旁组织的miRNA表达谱结果：癌组织中miR-9-5p表达下调7.6倍[18]。Table 1：Downregulation profle of miRNAs in 5 pairs of ccRCC and adjacent normaltissues，miR-9-5p was one of the remarkably downregulated miRNAs (7.6-fold)[18]图 1：44对肾透明细胞癌患者的癌组织及其癌旁正常组织miR-9-5p的相对表达情况Fig 1: Expression of miR-9-5p in 44 pairs of ccRCC specimens and adjacent normaltissues（***P＜0.001）

肾透明细胞癌,TNM分期,年龄,不同性别

3.2 miR-9-5p对肾透明细胞癌的临床价值miR-9-5p的表达水平与肾透明细胞癌患者的性别、年龄、肿瘤分期、分级、大小均无统计学相关性。（表2和图3）n % Mean±SEM(Normalized)PGenderM 24 54.5 0.2347±0.08497W 20 45.5 0.2987±0.1827 0.7389Age≤50 15 34.1 0.1123±0.04939>50 29 65.9 0.3422±0.139 0.2511TNM stageT1 38 86.4 0.2919±0.1082 0.6197aT2 3 6.8 0.09682±0.06718 0.7897bT3 3 6.8 0.075±0.03669 0.5810cFuhrman classificationⅠ/Ⅱ 36 81.8 0.2808±0.1126Ⅲ/Ⅳ 8 18.2 0.1872±0.11 0.7057Tumor diame

【参考文献】