蛋白质组学和生化实验揭示去整合素金属蛋白酶12亚型的不同调控机制

发布时间：2020-08-11 12:32

【摘要】：研究背景和目的:去整合素金属蛋白酶12(ADisintegrin And Metalloproteinase 12,ADAM12)是去整合素蛋白酶家族的一员。它主要有两个亚型,一个是跨膜的L型ADAM12L,另外一个是分泌的S型ADAM12S。它们主要由前肽结构域、金属蛋白酶结构域、去整合素结构域、富半胱氨酸结构域以及上皮生长因子样结构域构成。但它们的C端彼此不同,ADAM12S在其C端具有额外的34个氨基酸,取代ADAM12L中的205个氨基酸的跨膜和胞质尾区。末端结构的差异导致它们有不同的细胞定位和生物学功能。近年研究报道,ADAM12在多种癌症中高表达,如小细胞肺癌、乳腺癌、肝癌以及脑癌。也报道了在乳腺癌和前列腺癌病人的尿液中ADAM12的表达量与其病情息息相关。它能够促进癌细胞的增殖、迁移和转移,因而逐渐成为临床诊断的生物标志物。ADAM12作为一种金属蛋白酶,现有研究主要集中在寻找它的水解底物,探讨如何通过其酶的活性影响肿瘤的发生发展。但是还没有系统的研究它在细胞内的表达是如何被调控。我们前期已经通过质谱高通量方法筛选找到了 ADAM12L的相互作用蛋白,并且发现了一个ADAM12L的上游调控蛋白Myoferlin能够影响ADAM12L的酶活性。然而,对于ADAM12S的相互作用蛋白以及它们之间是否存在某种调控关系并影响其功能等问题还没有阐明。本论文主要通过蛋白质组学方法鉴定ADAM12S的相互作用蛋白,并探索它们之间的调控关系及对ADAM12S功能的影响。研究方法:我们通过在HeLa细胞内过表达ADAM12S-FLAG,收集细胞提蛋白后进行FLAG M2亲和树脂免疫纯化,并将纯化下来的样品进行免疫印迹验证蛋白纯化。通过对纯化的样品进行银染,发现差异条带后,将胶上的实验组与对照组的条带分别等分,胶内酶解蛋白成多肽后,通过LC-MS/MS进行分析。将得到的原始质谱数据用Proteome Discoverer以及MaxQuant进行定量分析处理,获得可能与ADAM12S相互作用的蛋白。对这些蛋白的功能进行生物信息学分析,找到可能影响ADAM12S功能的蛋白,进而通过生物化学方法验证它们之间的相互作用,探究它们的相互调控关系以及对ADAM12S功能的影响。研究结果:我们通过两次蛋白质组学生物学重复和两种定量分析方法鉴定到了16个与ADAM12S特异性相互作用的蛋白,其中只有一个蛋白与ADAM12L和ADAM12S共同作用。一方面,我们通过生物化学方法验证了 GRP94、P4HB、PDIA6、Vimentin、CANX等蛋白与ADAM12的相互作用。我们发现GRP94、PDIA6和P4HB均特异性地与ADAM12S相互作用,Vimentin特异性地与ADAM12L相互作用,CANX与ADAM12的两个亚型都有相互作用,这些实验和质谱结果一致。在与ADAM12S相互作用的蛋白中,我们发现了很多参与蛋白质折叠、促进蛋白分泌的分子伴侣,而且这些蛋白与肿瘤的发生发展有着密切的联系。另一方面,我们通过分子对接计算机模拟分析了 GRP94与ADAM12的相互作用,结果显示与ADAM12L相比,ADAM12S与GRP94结合更紧密。通过反拉实验我们进一步确证了它们之间的相互作用。在过表达GRP94的实验中,我们发现了 GRP94可以上调ADAM12S,而敲低GRP94后,细胞内的ADAM12S表达量降低,分泌到培养基内的ADAM12S成熟体也明显降低。虽然ADAM12S与蛋白质二硫键异构酶P4HB和PDIA6均有相互作用,但是P4HB并不影响ADAM12S的蛋白水平,而PDIA6能够上调ADAM12S的表达。我们进一步通过划痕实验证明了 ADAM12S促进了肿瘤细胞的迁移。研究结论:通过蛋白质组学方法鉴定了 ADAM12S特异性相互作用蛋白,并且通过生物化学方法证实它们之间的作用,发现GRP94可以通过增加ADAM12S的表达并促进其分泌。蛋白质二硫键异构酶家族的PDIA6和P4HB都能和ADAM12S相互作用,但是只有PDIA6能够影响其蛋白水平。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.2

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