miR-27a-3p抑制B4GALT3表达对胃癌BGC-823细胞增殖和侵袭的影响及机理研究

发布时间：2020-08-11 15:32

【摘要】：胃癌(Gastric carcinoma,GC),主要是指胃腺癌,在上消化道的恶性肿瘤中较为常见。根据2009~2011年中国流行病学统计结果预测胃癌在全国恶性肿瘤中的发病率和死亡率均位居第2位。虽然早期胃癌的临床表现不具有特征性,但随着人们健康意识的增强以及当今腔镜水平与诊断水平的提高,早期胃癌的诊断概率得到明显提高。这不仅延长了胃癌患者的生存时间,还相应地提高了胃癌患者的生活质量。而在精准医疗的推动下,从胃癌发生的源头,即分子水平防止胃癌的发生已成为当前科学研究的重中之重。在一些致癌因素的作用和影响下,基因组的稳定性减弱:癌基因活性增强,抑癌基因活性减弱以及肿瘤易感基因的突变,这些均能引起细胞蛋白质表达谱的改变,进而诱导肿瘤发生。micro RNAs在肿瘤的发生发展中作用明显,其发挥作用的原理与调控靶基因的机制已得到大量研究证实。β-1,4-半乳糖基转移酶Ⅲ(B4GALT3)是B4GALT家族的第3个成员,是合成多聚-N-乙酰氨基乳糖的关键酶,而多聚-N-乙酰氨基乳糖被修饰后表达肿瘤相关抗原。至今,B4GALT3在胃癌细胞中的表达以及对胃癌细胞生物学行为的影响尚一无所知。目的:探讨mi R-27a-3p对B4GALT3表达水平的影响以及对胃癌BGC-823细胞生物学行为的影响,为进一步研究B4GALT3对胃癌细胞生物学行为的影响奠定基础。方法:用Western blot检测B4GALT3蛋白在胃癌细胞——SGC-7901(中分化)、MGC-803(低分化)、BGC-823(低分化)与正常胃粘膜细胞(GES-1)中的表达情况;运用生物信息学方法获取与B4GALT3靶向结合的最佳mi RNA。通过瞬时转染,上调/下调BGC-823细胞中的mi R-27a-3p水平后,用Western blot检测B4GALT3蛋白在BGC-823细胞中表达变化情况,进而初步分析二者在胃癌细胞中的相互关系。采用MTT、划痕、Transwell迁移与侵袭以及Western blot等实验,观察mi R-27a-3p对胃癌BGC-823细胞生物学行为的影响。结果:Western blot显示B4GALT3在胃癌细胞系中高表达;通过生物信息学方法预测分析与B4GALT3靶向结合且符合条件的mi RNAs有7个,分别是:mi R-27a,mi R-27b,mi R-338-3p,mi R-125b,mi R-28-5p,mi R-379,mi R-491-5p;结合文献报道,我们选取mi R-27a进行后续研究,并发现mi R-27a-3p与B4GALT3 3'UTR的213~220位点相结合,结合序列为5'-ACUGUGA-3',故选择mi R-27a-3p进行研究;Western blot结果显示上调mi R-27a-3p后,B4GALT3蛋白表达水平下降,而抑制mi R-27a-3p后,B4GALT3蛋白表达增强,P0.05。MTT实验结果显示:在BGC-823细胞中上调mi R-27a-3p后,细胞的增殖活性明显增强,且在72 h~96 h处作用更明显;相反,抑制mi R-27a-3p后,细胞增殖活性明显减弱,P0.05。划痕实验显示,mi R-27a-3p mimic组的迁移距离高于对照组,抑制mi R-27a-3p后迁移距离明显低于对照组,P0.05。Trasnwell迁移实验显示:mi R-27a-3p mimic组迁移通过小室的细胞数量明显多于对照组;抑制mi R-27a-3p后,迁移细胞数量显著减少,P0.05。Trasnwell侵袭实验显示:mi R-27a-3p mimic组侵袭通过铺有BD基质胶小室的细胞数量多于对照组,而抑制mi R-27a-3p后,细胞数量少于对照组,P0.05。Western blot结果显示:mi R-27a-3p mimic能使E-cadherin和Claudin-1表达下调,使Vimentin、Slug和β-catenin表达上调(P0.05);相反,抑制mi R-27a-3p后,E-cadherin和Claudin-1表达上调,而Vimentin、Slug和β-catenin表达下调(P0.05)。结论:mi R-27a-3p可能通过抑制B4GALT3表达促进BGC-823细胞的增殖活性、迁移和侵袭及EMT进程。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

序列,残基,基因结构,橙色

化的主要成分—粘蛋白型 O-糖链糖基化在肿瘤中高表达，有利于肿瘤生物标记物的研究[11]。B4GALT3（Gene ID: 8703），全称 beta-1,4-galactosyltransferase 3，又称beta4Gal-T3，位于染色体 1q23.3 上，是β1，4 半乳糖基转移酶家族中的第 3 个成员（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8703）。Zhang M 等人[14]利用人胎盘cDNA 文库成功克隆出 B4GALT3，并指出在其编码区第 77 位，119 位，190 位以及 209 位氨基酸处存在四个保守的半胱氨酸残基，半胱氨酸残基对糖基转移酶催化反应中的二硫键形成至关重要[14, 15]。Henrik Clausen 等人[15]在 1997 年对B4GALT3 的全长编码序列的测序和克隆进行了相关描述，指出 B4GALT3 序列编码一个具有 4 个残基胞浆域、18 个残基穿膜域、1 个茎区或颈区域和 371 个残基催化域以及具有 4 个潜在 N-链糖基化位点的Ⅱ型跨膜糖蛋白。B4GALT3 基因的结构如图 1.1 所示。而且 B4GALT3 的编码区有 6 个外显子[15]，在 5'-非翻译区有一个 34 碱基的内含子[16]，全部序列与 B4GALT1 具有 44%的序列同源性[15]。

胃癌细胞系,表达水平,细胞,胃癌细胞

第四章结果4.1 B4GALT3 在不同胃癌细胞系中的表达情况Western blot 检测 B4GALT3 在胃癌 SGC-7901 细胞、MGC-803 细胞和BGC-823 细胞中的蛋白表达水平，并以 GES-1 细胞作为对照。结果如图 4.1 所示：相对于 GES-1 细胞，B4GALT3 在胃癌细胞中表达水平明显上调，具有统计学意义（P＜0.05）。

序列,软件预测,靶向,软件

图 4.2 软件预测与 B4GALT3 靶向结合的 miRNAs绿色代表该软件预测有 miRNA 与 B4GALT3 结合；红色代表该软件没有预测到 miRNA 与B4GALT3 有结合；黄色代表预测该 miRNA 的软件总数。通过 miRanda 对上一步筛选出的 miRNAs 进行热力学稳定性和序列保守性评分分析，结果发现上述 20 个靶 miRNAs 中同时满足热力学稳定性评分（mirSVR）绝对值≥0.1，且序列保守性评分（PhastCons）在 0.5～0.7 之间的有7 个，分别是 miR-27a，miR-27b，miR-338-3p，miR-125b，miR-28-5p，miR-379，miR-491-5p，如图 4.3 所示。其中评分位于前两位的 miR-27a，miR-27b 属同一家族，调控的靶基因类似。结合相关文献双荧光素酶报告基因检测证实[24]，可得出 B4GALT3 是 miR-27a 潜在的分子靶向基因。

【参考文献】