Sox4在胃癌上皮间质转化及干细胞特性中的作用研究

发布时间：2020-08-11 18:09

【摘要】：胃癌(Gastric cancer,GC)是最常见的消化道肿瘤,全球每年新发胃癌病例约95.1万例,死亡72.3万,发病率和死亡率居高不下,是威胁人类健康的重大疾病。我国由于存在食用腌制食品的习惯及人群普遍的幽门螺旋杆菌感染,胃癌的发病率相当高。每年的新发病例约占全球新发病例的一半,且大多数患者就诊时已经处于中晚期。尽管存在以手术和药物化疗为主的综合治疗方式,但胃癌的治疗却常因肿瘤转移和复发而失败。近年来,分子靶向治疗已逐渐成为治疗胃癌的有效手段,展示出了巨大的潜力。寻找灵敏的早期筛查标志物及有效的分子治疗靶点对胃癌的早期诊断和治疗具有相当大的临床意义。Sox 是一类性别决定基因(Sex determination region of Y chomosome,SRY),参与了人体胚胎发育、软骨形成、性别决定等生理过程,某些SOX家族成员还参与了癌症的进展。Sox4是Sox家族成员之一,在乳腺癌、结肠癌等肿瘤中扮演着原癌基因的角色。研究报道Sox4还在胃癌组织中高表达且提示患者预后不佳,那么Sox4究竟是通过何种机制在胃癌进展中扮演原癌基因的角色呢?这一点值得我们进一步研究。考虑到上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)与干细胞特性在肿瘤转移和复发过程中的关键作用,本研究在既往现象研究的基础上进一步从EMT及干细胞特性的角度出发探索Sox4在胃癌进展中所起的作用,以期望为胃癌的早期诊断和预后判断提供新的Marker,为开发胃癌治疗的药物提供新的靶点。为此,我们进行了以下研究:第一部分胃癌中Sox4的表达及临床意义目的:探索Sox4在胃癌中的表达模式及与患者预后之间的关系,探讨Sox4与胃癌间质化表型及干细胞表型的关系。方法:免疫组化检测84对胃癌组织与癌旁组织中Sox4及EMT、干性标志物的表达,利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析Sox4与胃癌患者总生存时间(Overall survival,OS)和无进展生存时间(Progression-free survival,PFS)的关系。实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测 30 例胃癌患者癌组织中Sox4、EMT及干性标志物的表达水平,利用直线相关模型分析了 Sox4与它们的相关性。结果:胃癌组织中Sox4的阳性染色率(65/84 vs 19/84)及染色评分(4.48 vs 2.25)均明显高于癌旁组织。Kaplan-Meier Plotter数据库纳入了 593例胃癌患者,生存分析表明Sox4高表达患者比低表达患者拥有更短的总生存时间和无进展生存时间。与Sox4低表达的胃癌患者相比,Sox4高表达患者的癌组织中上皮分子E-cadherin阳性表达率更低((20/65 vs 14/19),而间质分子 Vimentin(46/65 vs 6/19)及干性标志分子EpCAM表达率更高(40/65 vs 6/19)。进一步的qRT-PCR及相关性分析结果表明Sox4的表达与E-cadherin呈负相关(r=-0.384)而与Vimentin 及 EpCAM 呈正相关(r=0.674、0.433)。结论:Sox4在胃癌组织中表达上调,高表达的Sox4提示患者预后不良。Sox4导致胃癌患者预后不良可能与胃癌细胞的间质化表型和干细胞特性获取有关。第二部分Sox4促进胃癌细胞上皮间质转化及干细胞特性的研究目的:明确Sox4是否促进胃癌细胞的EMT和干细胞特性及并探讨相关机制。方法:(1)构建过表达慢病毒载体,转染Sox4内源性低表达的胃癌MKN28细胞株。构建沉默慢病毒载体,转染Sox4内源性高表达的胃癌BGC823细胞株。Transwell实验检测Sox4过表达和沉默前后细胞的迁移能力变化,qRT-PCR,Western blot及免疫荧光检测EMT分子的表达变化。悬浮成球实验观察Sox4过表达和沉默前后细胞的胃癌细胞自我更新能力的变化,并利用流式细胞仪检测CD44+/EpCAM+胃癌细胞的比例。(2)qRT-PCR及Western blot检测Sox4过表达和沉默前后细胞,EMT转录因子Twist1、Zeb1、Snai11、Snai12及干性转录因子Sox2、Oct4、Nanog的表达变化。Western blot及免疫荧光检测β-catenin的表达水平和定位情况。(3)构建裸鼠皮下移植瘤模型,在体内观察Sox4对胃癌细胞致瘤能力的影响。构建裸鼠肺转移模型,在体内观察Sox4对胃癌细胞转移能力的影响。结果:(1)过表达Sox4后,MKN28细胞迁移能力增强伴随着E-cadherin 的下调,N-cadherin 及 Vimentin 的下调。沉默 Sox4 后,BGC823细胞的迁移能力明显下降,伴随着E-cadherin的上调及Vimentin的下调。过表达Sox4后,MKN28细胞自我更新能力增强并伴随着CD44+/EpCAM+胃癌细胞的比例增多,沉默Sox4则在BGC823细胞得到相反的结果。(2)过表达MKN28细胞的Sox4后,EMT转录因子Twist1、Zeb1,干性转录因子Sox2、Oct4的表达上调,β-catenin的总蛋白水平表达上调并发生核转位。沉默BGC823细胞的Sox4后,Twist1、Snail1及干性转录因子Sox2、Oct4的表达下调,β-catenin的总蛋白表达水平表达下调。(3)过表达Sox4增加了 MKN28细胞的体内致瘤能力和肺转移能力,沉默Sox4则降低了 BGC823的体内致瘤能力和肺转移能力。结论:Sox4显著促进了胃癌细胞发生EMT并获取干细胞特性,其机制是上调了 EMT及干性转录因子的表达并激活Wnt通路。第三部分Sox4在TGF-β1诱导胃癌细胞恶性行为中的作用研究目的:探讨Sox4在TGF-β1促胃癌细胞EMT及干性获取中的作用。方法:利用 TGF-β1 诱导 MKN28 细胞,qRT-PCR 及 Western blot检测p-Smad2、Sox4的表达变化。利用TGF-β1诱导BGC823对照组和沉默组细胞,Transwell法检测细胞转移能力变化,悬浮成球法检测细胞自我更新能力变化。qRT-PCR及Western blot检测EMT及干性标志分子的表达变化。结果:TGF-β1诱导成功激活了胃癌细胞的TGF-β通路,并上调胃癌细胞Sox4的表达水平。沉默Sox4能够部分逆转TGF-β1诱导的EMT及干细胞特征,逆转TGF-β1诱导的E-cadherin的下调和Vimentin的上调。结论:Sox4介导了 TGF-β通路诱导的胃癌细胞恶性行为。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

胃癌及癌旁组织,基因,胃癌组织

逡逑中Ｓｏｘ４的平均染色强度也明显高于癌旁组织（图１．２）。不论是在胃癌组织还是癌逡逑旁组织中，Ｓｏｘ４阳性染色均主要位于细胞核和细胞團，二者并无显著差异。逡逑逦＊＊逦逡逑１５－１逦１逦Ｉ逦２０－逡逑■邋５逦▲逦Ｉ邋°－逦－－■■■■ＩＩ逡逑0逦ａ：逡逑ｏ－ｉ逦＜逦，逦邋－１０」逦１逡逑Ｃａｎｃｅｒ逦Ｎｏｒｍａｌ逦Ｃａｎｃｅｒ邋ｖｓ邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑图１．１邋Ｓｏｘ４基因在胃癌及癌旁组织中的表达情况。ｑＲＴ－ＰＣＲ检测３０对胃癌及癌旁组织中逡逑Ｓｏｘ４的ｍＲＮＡ表达水平，ＡＣＴ越高表达越低（左）。以癌组织Ｓｏｘ４的ｍＲＮＡ水平比上癌逡逑旁组织的ｍＲＮＡ水平得到相对表达倍数即２－△厶ＣＴ值（右）。逡逑Ｆｉｇ．１．１邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ＧＣ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋３０邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗｉｔｈ邋ＧＣ．逡逑Ｈｉｇｈｅｒ邋ＡＣＴ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｌｏｗｅｒ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ｌｅｆｔ）．邋Ｔｈｅ邋ｒａｔｉｏ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｃａｎｃｅｒ邋ｔｏ逡逑ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｉｓ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋２－ＡＡＣＴ邋（ｒｉｇｈ

胃癌及癌旁组织,蛋白,胃癌组织,癌组织

生存曲线,胃癌,胃癌及癌旁组织,患者预后

ｉｌｌ邋ｉ逡逑Ｇａｎｃｓｒ逦Ｍｏｎ－ｃ３ｎｃ６ｒ逡逑图１．２邋Ｓ0Ｘ４蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达情况。Ａ．代表性的Ｓｏｘ４免疫组化染色图片（ｘ逡逑４００）邋；Ｂ．胃癌和癌旁组织中Ｓｏｘ４的平均染色评分。逡逑Ｆｉｇ．１．２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｓｏｘ４邋ｐｒｏｔｉｅｎ邋ｉｎ邋ｃａｎｃｅｒ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋８４邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ｗｉｔｈ逡逑ＧＣ．邋Ａ．邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋Ｓｏｘ４邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｉｎ邋ＧＣ邋ａｎｄ邋ｍａｔｃｈｅｄ邋ｎｏｎｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋８邋ｔｙｐｉｃａｌ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ逡逑ｂｙ邋ＩＨＣ．邋Ｂ．邋Ｔｈｅ邋ｍｅａｎ邋ｓｃｏｒｅ邋ｆｏｒ邋ａｌｌ邋ＧＣ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ａｎｄ邋ｍａｔｃｈｅｄ邋ｎｏｎ－ｃａｎｃｅｒ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｗｅｒｅ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ．逡逑Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋士邋ＳＤ邋ａｎｄ邋ｗｅｒｅ邋ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｔｗｏ－ｓａｍｐｌｅ邋ｔ－ｔｅｓｔ．邋＊＊Ｐ邋＜逡逑０．０１．逡逑２．２邋Ｓｏｘ４的表达与胃癌患者预后之间的关系逡逑Ｃｈｉａ－Ｌａｎｇ邋Ｆａｎｇ等人的研究表明Ｓｏｘ４高表达的患者具有更短的总生存期，这逡逑提示Ｓｏｘ４作为一个原癌基因导致胃癌患者预后不良。考虑到Ｃｈｉａ－Ｌａｎｇ邋Ｆａｎｇ只纳逡逑入了邋１６８位患者且只探讨了细胞核Ｓｏｘ４与患者预后的关系，我们有必要扩大样本逡逑量对结果进行进一步验证。为此

【参考文献】