组蛋白乙酰转移酶MOF在炎症及肿瘤中的作用及其调控机制研究

发布时间：2020-08-14 09:40

【摘要】：组蛋白乙酰化是组蛋白翻译后修饰的一种的重要方式,在调控真核生物的基因表达中发挥着至关重要的作用。组蛋白乙酰化可参与多种细胞生物过程,因此,其异常调控与人类的多种疾病发生相关。这一修饰方式由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰转移酶(HDACs)共同调节。MOF,也称MYST1或KAT8,是组蛋白乙酰转移酶MYST家族(Moz-Ybf2/Sas3-Sas2-Tip60)的一员。MOF存在于两种蛋白复合物(MSL和NSL)中发挥其生物学功能。这两种复合物均可催化组蛋白H4第16位赖氨酸(H4K16)的乙酰化,而NSL复合物还可乙酰化H4K5和H4K8位点。MOF可调控多种细胞过程,在基因转录活性调控、维持基因组稳定性、DNA损伤修复、细胞周期调控及早期胚胎发育中发挥着重要作用。MOF及其相关复合物活性异常可引起严重的细胞功能障碍,从而导致细胞死亡或细胞恶性增殖。研究证明,MOF及其作用底物H4K16的乙酰化水平缺失已成为人类肿瘤的一个普遍标志。但也有研究发现MOF在非小细胞肺癌组织中高表达,可见MOF在肿瘤发生中的调控作用是复杂多样的,这提示我们MOF在不同肿瘤中的可能存在不同的调控靶点。MOF除了在肿瘤疾病中发挥重要作用外,有研究报道MOF可调控T细胞的分化,T细胞特异性敲除MOF可导致小鼠免疫功能丧失,这表明MOF在调控T细胞功能中的重要性。另有研究报道在炎症性肠病患者的结肠组织中H4K16的乙酰化水平存在异常,提示MOF可能在炎症性疾病中同样发挥重要作用。本研究分为两个部分,第一部分初步探讨了 MOF在实验性结肠炎小鼠炎症发生中的作用及可能的调控机制,第二部分研究了 MOF对乳腺癌中雌激素受体ERα表达的调控作用及机制,本研究的发现及得出的结论将丰富我们对MOF调控炎症疾病及乳腺癌肿瘤作用机制的理解,并可能成为一个新的治疗靶点。第一部分组蛋白乙酰转移酶MOF在炎症性肠病中的作用及调控机制研究目的:明确组蛋白乙酰转移酶MOF在炎症性结肠病中的作用,通过葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型研究了 MOF在小鼠实验性结肠炎发生发展中的作用,初步探讨其可能的调控机制。研究方法:1.葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠结肠炎发生过程中MOF的表达变化选择6-8周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠,收集饮用3.5%DSS诱导不同时间(第0、3、7天)结肠炎小鼠的结肠组织,提取RNA、蛋白和制备组织切片,分别利用RT-qPCR、Western blotting、组织免疫化学染色法,检测MOF和H4K16ac在炎症发生过程的表达情况。2.MOF基因缺失对DSS诱导小鼠结肠炎发生发展的影响通过Mofflox/flox和ER-Cre转基因小鼠杂交获得基因型为Mof flox/flox;-Cre+的小鼠,利用Cre/loxP重组酶系统,腹腔注射他莫昔芬(TAM)诱导Cre重组酶表达而获得Mof基因敲除小鼠(Mof-cKO)。选择6-8周龄雄性的Mof fl/fl;ER-Cre-(对照)和Mof-cKO小鼠进行实验,分别给予正常饮水和3.5%DSS溶液建立结肠炎模型。实验过程中记录小鼠体重变化、血便情况,结肠长度,对结肠组织切片进行HE染色并做组织病理学评分。3.MOF对Th17细胞相关基因表达的影响3.1 Western blotting检测MOF对I117a蛋白表达的影响;3.2 RT-qPCR检测MOF对Th17细胞相关因子表达的影响,包括Thl7细胞分泌因子I117a和1122,转录因子RORyt、RORα和Sata3,分化调控因子TGF-β1 和 I1-6;3.3用MOF抗体进行ChIP-qPCR,检测MOF在I117a和RORyt基因启动子结合情况。4.RNA-seq分析敲低MOF对结肠组织基因表达谱的影响筛出炎症相关的差异表达基因,分析其参与的信号通路。研究结果:1.RT-qPCR 和 Western blotting 结果说明,MOF 和 H4K16ac 在 DSS 诱导结肠炎过程中表达上调;2.IHC染色结果发现,在小鼠结肠炎发生过程中MOF主要分布在结肠组织黏膜层细胞中;3.Mof敲除后可改善小鼠的结肠炎症状,表现为体重下降程度减小,结肠缩短程度减小,HE染色结果组织病理学评分降低;4.Mof敲除可降低Th17细胞相关因子的表达,包括I117a、I122、RORyt、RORa、Sata3、TGF-β1 和 I1-6,Mof 可与 I117a 和 RORyt 启动子区结合;5.RNA-seq结果发现655个差异表达基因,68个基因(10.4%)与炎症反应调控或免疫性疾病相关,其中47个基因的表达是下调的。结论:1.MOF在DSS诱导的小鼠结肠炎反应中表达逐渐升高,提示MOF参与DSS诱导的小鼠结肠炎反应。2.敲除MOF可改善DSS诱导的小鼠结肠炎的症状。3.敲除MOF可下调Th17细胞功能和分化关键因子的表达而减弱小鼠结肠炎炎症反应。第二部分乳腺癌中组蛋白乙酰转移酶MOF对雌激素受体ERα表达的调控作用研究目的:雌激素受体ERα激活异常是促进乳腺癌发生发展的危险因素,其表达缺失也是内分泌治疗耐药和抵抗的重要原因,ERα蛋白再表达是恢复内分泌治疗敏感性的重要途径。分析MOF和ERα在乳腺癌组织和细胞中的表达相关性,研究MOF对ERα蛋白表达的调控作用机制,为实现ERα蛋白再表达治疗提供新的作用靶点。研究方法:1.乳腺癌组组织和细胞中MOF和ERα之间的表达相关性1.1利用谷歌生物公司的乳腺癌组织芯片,通过免疫组织化学法(IHC)分别检测MOF和ERα在乳腺癌组织中表达情况,并分析两种蛋白在乳腺癌组织中表达水平的相关性;1.2选择ERα表达阳性的乳腺癌细胞系MCF7、T47D和ERα表达阴性的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 和 HCC1937,Western blotting 检测 MOF 在 ERα 阳性和阴性乳腺癌细胞中的表达差异,在乳腺癌细胞系中确认MOF和ERα的表达相关性;1.3在ERα阳性细胞系MCF7和T47D细胞中,通过脂质体分别转染上调表达MOF 的 pcDNA3.0-Flag-HA-MOF(FH-MOF)及其空白载体(Vector)和敲低MOF 表达的 pGpu6-shMOF 及其对照 pGpu6-shControl,RT-qPCR、Western blotting检测MOF表达变化对ERα表达的影响;1.4分别在无雌激素(E2)刺激和E2刺激的条件下,在MCF7细胞中过表达MOF,Western blotting检测MOF对ERα蛋白的调控作用是否是E2依赖性的;1.5分别通过核质分离实验和细胞免疫荧光实验,检测MOF对E2刺激ERα蛋白细胞核定位改变的影响。2.MOF对ERα转录活性及介导的促乳腺癌细胞增殖能力的影响2.1对照MCF7细胞和MOF过表达MCF7细胞分别用E2 处理 0h、1h,3h和6h,RT-qPCR 检测 MOF 对 E2 刺激 ERα 靶基因(TFF1,CCND1,GREB1)的激活表达影响;2.2用ERα抗体进行ChIP实验,qPCR检测MOF对ERα在靶基因启动子结合能力的影响。2.3分别通过CCK8实验和异种移植瘤实验检测MOF对E2促进MCF7细胞增和体内成瘤能力的影响。3.MOF影响ERα蛋白水平的调控机制3.1在MCF7细胞,用MG132处理对照细胞和MOF过表达细胞,Western Blotting检测MOF对ERα蛋白合成的影响;3.2在MCF7细胞,用CHX处理对照细胞和MOF过表达细胞,Western Blotting检测MOF对ERα蛋白降解的影响;3.3在293T细胞分别转入6×His-ERα和FH-MOF质粒,用CHX处理对照细胞和MOF过表达细胞,Western Blotting验证MOF对ERα蛋白降解的影响;3.4用ERα抗体进行Co-IP实验,Western Blotting检测MOF对ERα蛋白泛素化水平的影响;4.MOF增加ERα蛋白泛素化水平的机制4.1通过对MOF过表达细胞RNA-sequencing结果分析和文献查阅,并通过RT-qPCR和Western Blotting验证,找到MOF影响其表达的E3连接酶Cul4a和Cul4b;4.2通过小干扰RNA siCul4a和siCul4b分别敲低Cul4a和Cul4b的表达,Western Blotting检测对ERα蛋白表达的影响。4.3 Co-IP实验验证Cul4b与ERα蛋白的相互作用以及Cul4b对ERα蛋白泛素化水平的影响;4.4 Co-IP实验验证MOF对Cul4b与ERα蛋白之间相互作用的影响;4.5无E2刺激条件下,用Lys-Ac抗体进行Co-IP实验,Western Blotting检测MOF对HSP90和ERα乙酰化水平影响。4.6无E2刺激条件下,用ERα抗体进行Co-IP实验,Western Blotting检测MOF对HSP90和ERα相互作用的影响;5.MOF对ERα阴性乳腺癌细胞HCC1937细胞中ERα蛋白再表达的影响5.1 用 pGPU6-shMOF 质粒敲低 HCC1937 细胞 MOF 表达,Western Blotting 检测ERα蛋白表达情况;5.2用MOF小分子抑制剂MG149抑制HCC1937细胞中MOF酶活性,Western Blotting检测ERα蛋白表达情况;5.3用MG149和他莫昔芬(TAM)共同处理HCC1937细胞,通过CCK8实验检测MOF对HCC1937细胞TAM抵抗作用的影响。研究结果:1.乳腺癌组织芯片IHC结果分析,MOF与ERα表达呈负相关性;2.在乳腺癌细胞系中分析MOF表达,结果表明MOF在ERα阳性细胞系中低表达,在ERα阳性细胞系中高表达;3.在MCF7和T47D细胞中,分别过表达和敲低MOF后ERα的mRNA水平无显著变化,但过表达MOF可下调ERα蛋白水平,而敲低MOF可上调ERα蛋白水平;4.MG132处理MCF7细胞,结果发现MOF不影响ERα蛋白合成过程;5.CHX处理MCF7细胞,结果表明MOF可加速ERα蛋白的降解过程;6.在293T细胞中验证,MOF可加速ERα蛋白的降解过程;7.Co-IP实验检测ERα蛋白泛素化水平变化,结果发现MOF可增加ERα蛋白泛素化水平;8.MOF可上调Cu14a和Cu14b的表达,但干扰Cu14a表达后对ERα蛋白无明显影响,而干扰Cu14b表达后可上调ERα蛋白表达,并恢复MOF对ERα蛋白的抑制作用;9.Co-IP实验结果发现Cu14b和ERα可相互作用,干扰Cu14b表达后可减少ERα蛋白泛素化水平;10.过表达MOF可增强Cu14b和ERα的相互作用;11.无E2刺激条件下,过表达MOF可增加HSP90的乙酰化水平,并减弱HSP90和ERα相互作用;12.抑制MOF表达后可诱导HCC1937细胞中ERα蛋白再表达;13.MG149抑制HCC1937细胞中MOF酶活性后,ERα蛋白也可再表达;14.MG149和TAM共同处理HCC1937细胞后可恢复HCC1937细胞对TAM的敏感性。结论:1.在乳腺癌组织和细胞中MOF和ERα的蛋白表达水平呈负性相关关系。2.MOF抑制ERα蛋白表达及其介导的促乳腺癌细胞增殖能力。3.MOF通过泛素蛋白酶体途径降低ERα蛋白稳定性。4.MOF上调Cu14b的表达而增加ERα泛素化水平降低其蛋白稳定性。5.无雌激素刺激时,MOF增加HSP90的乙酰化水平使其失去分子伴侣功能引起ERα的降解。6.抑制MOF酶活性可激活ERα阴性乳腺癌细胞中ERα蛋白表达,并提高对他莫西芬的敏感性。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.2
【图文】：

方法检测了小鼠结肠炎发生过程中ＭＯＦ及Ｈ４Ｋ１６ａｃ的表达情况。我们选择给予逡逑３．５％邋ＤＳＳ自由饮水当天为第０天，分别于第３天和第７天麻醉处死小鼠，取其逡逑远端结肠组织进行后续检测。如图１Ａ所示，１１１７ａ是己知的参与ＤＳＳ诱导结肠逡逑炎反应的重要分子，ＲＴ－ｑＰＣＲ结果显示１１１７ａ的ｍＲＮＡ水平于ＤＳＳ诱导第３天逡逑和第７天表达显著升高，说明小鼠结肠组织发生炎症反应。随着ＤＳＳ诱导炎症逡逑反应加重，ＭＯＦ的ｍＲＮＡ表达水平于炎症早期（第３天）开始显著升高。与逡逑ｍＲＮＡ水平表达变化一致，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示在ＤＳＳ诱导结肠炎发生过逡逑程中，ＭＯＦ的蛋白水平显著升高（图１Ｂ邋）。同时，Ｈ４Ｋ１６的乙酰化水平（Ｈ４Ｋ１６ａｃ）逡逑表现出与ＭＯＦ邋—致的变化（图１Ｂ）。图１Ｃ所示为图１Ｂ中ＭＯＦ、Ｈ４Ｋ１６ａｃ和逡逑１１１７ａ的蛋白相对表达强度。我们还通过ＩＨＣ方法检测了邋ＭＯＦ在小鼠结肠组织逡逑中的定位表达情况，发现在小鼠结肠炎发生过程中ＭＯＦ主要分布在结肠组织黏逡逑膜层细胞中（图１Ｄ）。综上所述，这些结果表明，ＭＯＦ参与ＤＳＳ诱导的结肠炎逡逑的炎症反应

注射ＴＡＭ，每只小鼠每天剂量为１００ｍｇ／ｋｇ，连续注射５天，４天后检测小鼠结逡逑肠组织ＭＯＦ敲除效率。ＲＴ－ｑＰＣＲ结果显示经ＴＡＭ诱导后结肠组织中ＭＯＦ逡逑ｍＲＮＡ表达水平降低了约８０％（图２Ａ）。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测结果显示ＭＯＦ蛋逡逑白水平也显著降低（图２Ｂ）。逡逑确认ＭＯＦ敲除的效率后分别给予对照组小鼠和Ｍｏｆ－ｃＫＯ小鼠正常饮水和逡逑３．５％邋ＤＳＳ饮水处理，每天观察记录小鼠体重变化及血便情况，７天后麻醉处死逡逑各组实验小鼠，取结肠组织检测结肠炎各项指标变化，包括体重下降程度、血便、逡逑结肠长度缩短和病理改变。如图２Ｃ所示，正常饮水的对照组小鼠和Ｍｏｆ－ｃＫＯ小逡逑鼠体重之间没有显著差异，说明敲除ＭＯＦ表达后短期内对小鼠体重没有显著影逡逑响。与对照组结肠炎小鼠相比，Ｍｏｆ－ｃＫＯ的结肠炎小鼠体重下降程度明显减轻。逡逑Ｍｏｆ－ｃＫＯ结肠炎小鼠的血便量也显著少于对照结肠炎小鼠。除此之外，正常饮水逡逑的对照组小鼠和Ｍｏｆ－ｃＫＯ小鼠的结肠长度没有显著差异，而Ｍｏｆ－ｃＫＯ结肠炎小逡逑鼠的结肠长度明显长于对照结肠炎小鼠（图２Ｄ、Ｅ）

与ＥＲ结合后，改变其构象，与伴侣蛋白如热休克蛋白ＨＳＰ９０分离，形成二聚体逡逑并与靶基因启动子区的ＥＲＥ结合，再通过招募各种组蛋白乙酰转移酶（ＨＡＴ）等辅逡逑助激活因子促进基因转录活化（图１）邋［＆９］。这一过程是经典的雌激素信号通路。逡逑一些辅激活因子对ＥＲ功能是不可或缺的［１Ｑ，ｎ］。ＥＲ还可通过募集组蛋白脱乙酰逡逑酶（ＨＤＡＣ）结合来介导某些基因的抑制作用。上述过程为经典的雌激素信号通路。逡逑ＥＲ已被证明通过与其他转录因子相互作用来调节基因的表达。因此，ＥＲ本逡逑身可作为辅助调控因子协助转录因子复合物与ＤＮＡ序列的结合｜３］。ＥＲ通过逡逑非经典基因组作用参与许多重要基因的调控，如ＣｙｃｌｉｎＤｌ、ＭＹＣ、ＢＣ１２和ＩＧＨＲ。逡逑ＥＲ的非经典基因组作用不仅可能在乳腺癌细胞增殖和存活中发挥重要作用，也逡逑可能在内分泌治疗耐药性的发展中发挥重要作用。逡逑Ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ逡逑Ｘ邋＾７ｌｆｌＥＧＲ，邋＼逡逑／逦Ｇｒｏｗｔｈ逦ＥＲＢＢ２逦＼逡逑ａ邋／逦ｆａｃｔｏｒｓ逦ａｎｄ邋ＩＧＦＲ逦邋＼邋ｃ逡逑／逦（Ｒａｓ）邋（ＰＩ３Ｋ）逦／逦＼逡逑Ｘ邋Ｉ邋ｉ邋ｄ邋Ｖ逡逑’逦？邋＠逦ｅ（ｆＥＬ翁逡逑＼逦？邋Ｗ逦４逦／逡逑＼邋、姞逦？逦？逡逑Ｃｙｔｏｐｌ＾ＪＵ邋一－邋＇逦ｔ逡逑０逦v|邋？逦？逡逑ＥＲＥ逦ＳＲＥ逦ＲＥ逡逑Ｖ逦ｍＲＮＡ邋Ｘ逦Ｊ逡逑、逦逦邋一＾ＡＡＡＡＡ邋＾’逡逑逦■逡逑ＭＹＣ，邋ｃｙｃｌｉｎ邋Ｄｌ，逡逑ｃｙｃｌｉｎ邋Ｅｌ邋ａｎｄ邋ｃｙｃｌｉｎ邋Ｅ２逡逑%煎义希牵颍铮鳎簦

本文编号：2792855