microRNA-100靶向作用于SNAI1诱导上皮间质转化抑制肝细胞肝癌侵袭转移的研究

发布时间：2020-08-15 09:49

【摘要】：背景根据病理类型的不同,肝癌可分为肝细胞性肝癌、胆管细胞性肝癌和混合性肝癌,其中90%属于肝细胞性肝癌~([1])。因此本研究主要讨论是肝细胞性肝癌。肝癌因预后差,死亡率高,被称为癌中之王~([2-3])。肝癌的发生发展具有起病隐匿、临床症状、体征不典型及病情进展迅速等特点,从而导致其发病率和死亡率逐年升高~([4])。由于肝癌的存活率低,发病较为隐匿,多数肝癌确诊已为中晚期,已失去有效治疗的机会,因此肝癌的早期诊断就显得十分重要。肝癌预后差,肝癌侵袭和转移是影响肝癌患者疗效和获得长期生存的关键问题~([5])。目前,肝癌的侵袭转移机制尚不十分清楚,随着对肝癌的深入研究,特别是分子生物学的进步,肝癌的基因治疗逐渐成为临床应用中很具前景的靶向治疗,寻找新的有效的治疗手段成为国内外研究的热点之一~([6,7])。肝细胞肝癌的侵袭转移是一个复杂的、多步骤的过程,其中降解细胞外细胞外屏障是肿瘤侵袭转移的始动步骤~([8,9])。微小RNA(MicroRNAs,miRNAS)是一类短小的,高度保守的内源性非编码RNA,在真核生物中发现的可以实现调节功能,长度约21-25个核苷酸(nt)。MicroRNAs(miRNAS)在恶性肿瘤的发生发展中起到重要的作用。大量的MicroRNAs(miRNAS)的靶基因是抑癌基因或癌基因,且多个MicroRNAs(miRNAS)分子被证实参与肝癌的侵袭转移的多个环节。微小RNA能够识别特定目标mRNA或抑制蛋白翻译,从而转录水平发挥负调控作用。超过一半的人类MicroRNAs(miRNAS)基因位于脆弱位点或包含有肿瘤肿瘤相关基因的区域,而且MicroRNAs(miRNAS)有着广泛的生物学功能,包含了细胞的凋亡、增殖、代谢、分化及肿瘤的生长调控及形成过程等。MicroRNAs(miRNAS)沉默靶基因的主要分子生物学机制是通过MicroRNAs(miRNAS)保守的种子区域序列(约2-7个核苷酸(nt))特异的结合靶基因的3-UTR而实现的。RNA技术是近些年发展起来的基因沉默技术,是利用双链RNA特异性地降解具有同源序列的mRNA,从而沉默相应基因的表达~([10-13])。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是细胞由上皮状态向间质状态转化的过程,它也是细胞转移的重要特点。上皮间质转化对于肿瘤的恶化发展都具有重要的影响,能够显著增强肿瘤细胞的侵袭能力。在EMT过程中,上皮功能的丧失以及间质功能的获得显著增强了细胞的迁移和侵袭能力。E-cadherin是上皮细胞的特异分子标记物,Vimentin是间质细胞的特异分子标记物,因此Vimentin蛋白的获得以及E-cadherin蛋白的丢失表明细胞发生了上皮间质转化~([14-16])。SNAI1(snail)是一个与EMT密切相关的转录因子,它能够抑制E-cadherin表达并促进肿瘤的迁移和侵袭。上皮间质转化在肿瘤的侵袭转移中起到了关键作用,并与患者的不良预后密切相关~([17-19])。在多种肿瘤的上皮间质转化过程中,都出现了SNAI1的异常表达。近年来越来越多的证据显示,SNAI1在EMT的调节过程中具有十分重要的作用。此外SNAI1诱导的E-cadherin下调被证实在触发肿瘤细胞的上皮间质转化过程中具有关键性作用~([20-21])。肿瘤细胞的侵袭转移是一个多阶段的复杂的过程,包括在血液循环中的转运,对周围组织的浸润及远端转移灶的形成等多个环节,在以上过程中,肝癌细胞的上皮间质转化被认为是一个特征性事件~([22-24])。microRNA-100定位于人类染色体11q24.1,大小约为22个核苷酸,位于人染色体11q24.1,其种子序列区含有双GC对,另一末端为TA,这一结构特点决定其靶基因种类少,种子序列区结合力强~([25-27])。既往的研究表明,microRNA-100在不同的病变中呈现不同的表达方式。既往的研究发现,在膀胱癌的细胞、组织中,microRNA-100的表达是下调的,体外过表达microRNA-100是能够对膀胱癌细胞的侵袭和转移起到抑制作用~([29-30])。现已证实在多种肿瘤细胞中,miRNA-99a/100通过mTOR的转录后调节并改变细胞的增值迁移功能~([31-32])。我们在前期的研究中发现microRNA-100在正常的人肝细胞中高表达,而在肝细胞肝癌细胞株中低表达。隋承光的研究发现,过表达的microRNA-100通过抑制mTOR的表达抑制肝癌的迁移和侵袭能力,主要通过上调上调E-cadherin的表达,阻断了EMT的发生过程~([33])。近年来,microRNA-100在肝癌的发生与发展中的作用备受关注,但microRNA-100在肝细胞肝癌起的具体作用及其如何引起肝细胞肝癌的侵袭转移的具体机制尚不十分明确,本研究进一步探讨microRNA-100导致肝细胞肝癌细胞侵袭及迁移的可能机制,从而为肝细胞肝癌的临床诊断和治疗提供新的线索,为寻找肝细胞肝癌新的治疗靶点奠定分子生物学基础。目的本实验通过探讨microRNA-100在肝细胞肝癌中的表达及其对肝细胞肝癌细胞的迁移和侵袭的影响,进而研究microRNA-100在肝细胞肝癌发生发展中的作用,进一步探讨microRNA-100导致肝细胞肝癌细胞侵袭及迁移的可能机制,为寻找肝细胞肝癌新的治疗靶点奠定分子生物学基础。方法1.运用qRT-PCR的方法探讨microRNA-100在肝细胞肝癌组织及相应癌旁组织中的表达情况,进而分析microRNA-100的表达与肝细胞肝癌患者的预后和临床病理学特征之间的相互关系。2.运用qRT-PCR的方法检测了HepG2,Huh7,Hep3B,MHCC97L,SMMC7721和MHCC97H肝癌细胞系以及人类永生化肝细胞系LO2中microRNA-100的表达情况,进一步探讨microRNA-100的表达水平对肝癌的侵袭转移方面的影响程度。3.运用免疫组化的方法检测了肝癌组织中SNAI1蛋白、Vementin蛋白及E-cadherin蛋白的表达水平,并分析了它们的表达量与microRNA-100的相关性。4.应用microRNA-100inhibitor及microRNA-100mimics转染MHCC97H和SMMC7721细胞,然后分别运用Transwell侵袭实验和划痕实验检测细胞侵袭及迁移能力的变化。5.应用microRNA-100mimics及microRNA-100inhibitor转染MHCC97H和SMMC7721细胞后,运用western-blot法检测细胞中Vementin及E-cadherin蛋白表达量的变化。6.应用microRNA-100mimic及microRNA-100inhibitor分别与SNAI1过表达载体共转染MHCC97H细胞,然后运用划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力的变化。7.应用microRNA-100mimics及microRNA-100inhibitor转染MHCC97H和SMMC7721细胞,然后分别运用qRT-PCR及western-blot法检测细胞中SNAI1 mRNA及蛋白的表达变化。8.运用荧光素酶报告基因验证microRNA-100是否通过与SNAI1的3、-UTR区结合而对其产生了抑制作用。9.应用microRNA-100mimics或microRNA-100inhibitor分别与SNAI1过表达载体共转染MHCC97H细胞,然后运用western-blot法检测细胞中E-cadherin及Vementin蛋白表达量的变化。结果1.microRNA-100在肝癌组织中较相应癌旁组织中的表达明显下调,且microRNA-100的表达下调与肝内转移,较晚TNM分期和较高的Edmonson分级显著相关(P0.05);进一步用多因素COX回归分析及Kaplan Meier生存曲线显示microRNA-100的下调预示了肝细胞肝癌患者较短的无病生存期(HR=2.7;P=0.003)。2.在所有检测的肝细胞系中均能测到microRNA-100的表达,microRNA-100在MHCC-97H细胞中表达最低,而在正常永生化的LO2细胞中表达最高。在肝癌组织标本中,转移组中的microRNA-100的表达水平明显低于非转移组(P0.001)。3.microRNA-100过表达抑制了MHCC97H和SMMC7721细胞的迁移和侵袭;敲低miR-100则促进了MHCC97H和SMMC7721细胞的迁移和侵袭。4.在MHCC97H和SMMC7721细胞中,敲低microRNA-100则促进了Vimentin蛋白的表达,抑制了E-cadherin蛋白的表达;过表达microRNA-100促进了E-cadherin蛋白的表达,抑制了Vimentin蛋白的表达。5.在70例肝细胞肝癌组织中,microRNA-100的水平与E-cadherin蛋白的表达量呈正相关(r=0.639 P0.01);与Vimentin蛋白的表达量呈负相关(r=-0.456,P0.01)。6.SNAI1是microRNA-100的直接靶标。7.在MHCC97H和SMMC7721细胞中,过表达microRNA-100抑制了SNAI1 mRNA及蛋白的表达;敲低microRNA-100则促进了SNAI1 mRNA及蛋白的表达。8.在70例HCC组织中,microRNA-100的水平与SNAI1蛋白的表达量呈负相关(r=-0.615,P0.001)。microRNA-100通过作用于SNAI1,影响了细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化的改变。结论1.microRNA-100的表达降低或缺失对肝癌细胞的抑制作用降低,下调的microRNA-100是通过促进SNAI1的表达进而促进了细胞的上皮间质转化的改变,从而引起了细胞的侵袭和转移。2.在肝细胞肝癌中,下调的microRNA-100促进了细胞的侵袭迁移及上皮间质转化的改变。3.microRNA-100在肝细胞肝癌组织中较癌旁组织的表达明显下调,microRNA-100的低表达与肝细胞肝癌多个恶性临床病理学指标密切相关,且与肝细胞肝癌患者的不良预后密切相关。4.microRNA-100有望作为肝细胞肝癌患者潜在的预后指示因子。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

载体,图谱,报告基因,目的

计数的方法来统计我们的实验结果对这 5 个视野进行侵袭细胞的计数实验结果的准确性，我们需要对每验报告实验报告基因的载体本实验流程是：我们先设计并合成们实验要的目的片段，然后通过目的入酶切后的报告基因载体上。我们中，然后我们先行 PCR鉴定长出的成功的含目的序列的报告基因载体面的图 1-8 所示：Synthetic poly(A)

肝癌组织,肝细胞肝癌,表达水平,肝癌

结果肝癌及其癌旁组织中 microRNA-100 的表达水平.1 肝癌组织中的 microRNA-100 表达水平明显低于其癌旁组织中的表a 本研究收集了 70 例肝癌组织及对应癌旁组织标本，运用 qRT-roRNA-100 在肝细胞肝癌组织中的表达水平，检测了 microRNA-100 在肝癌中的表达情况。b 结果显示：microRNA-100 在 HCC 组织中较相应癌旁组织中均有不同程 microRNA-100 在 HCC 组织中较相应癌旁组织中表达下调的病例占到全8 /70 例，图 2-1），以下将研究 microRNA-100 在肝细胞肝癌中的侵袭制。

肝癌转移,内参

microRNA-100在肝癌转移组及未转移组中表达水平的比较（***P<0.001；内参为RUN6B）

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