放化疗是恶性肿瘤的主要治疗手段,吉西他滨是临床上治疗实体瘤和淋巴瘤的常用化疗药物,常常导致血小板减少,不但影响肿瘤治疗,甚至可能发生危及生命的出血风险。目前吉西他滨及电离辐射对巨核细胞增殖、多倍体形成、分化成熟及血小板生成的影响及具体机制目前尚不完全清楚,阐明这一问题及机制,为减轻放化疗导致血小板减少这一副作用具有重要意义。目的:探讨化疗药物吉西他滨对巨核细胞的增殖、分化成熟及血小板生成这一过程的影响和作用机制,低剂量辐射对巨核细胞增殖、分化成熟及血小板生成的影响及对吉西他滨引起的血小板减少的保护作用。方法:1.吉西他滨对巨核细胞的增殖、分化及血小板生成的影响及机制研究体外研究:(1)通过WST-1实验检测吉西他滨作用后巨核细胞增殖抑制率的变化。(2)通过CD41-FITC/PI双染、CD41-FITC/CD61-PE双染、Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测吉西他滨作用后巨核细胞多倍体形成、巨核细胞分化指标(CD41+/CD61+)及凋亡率的变化情况。(3)应用活细胞工作站的活细胞微分干涉相差显微镜观察吉西他滨作用后的巨核细胞产生前血小板的过程的影响,并制作视频。应用光学显微镜观察并计数吉西他滨作用后的正在产生前血小板的巨核细胞的数量的变化。(4)通过实时定量Real-time PCR(q PCR)方法检测吉西他滨作用后转录因子GATA-1、NF-E2、Fli-1及细胞周期相关蛋白的基因p21、Cyclin D1、Cyclin E1的表达变化。(5)通过Western blot方法检测吉西他滨作用后ERK1/2、p-ERK1/2、p-P38、P38、AKT、p-AKT和LC3表达的变化。体内研究:(1)小鼠眼眶静脉取血法,应用小鼠五分类血球仪进行血细胞计数,观察吉西他滨处理后的小鼠血小板计数的变化情况并绘制曲线。(2)尾静脉注射NHS-biotin标记血小板,眼眶静脉取血后Streptavidin-PE/CD41-FITC标记血小板,流式细胞仪检测吉西他滨处理后每日NHS-biotin标记的血小板所占比例,连续检测5 d,绘制血小板寿命曲线。(3)小鼠眼眶静脉取血后留取血清检测TPO、SDF1、IL-1细胞因子水平,颈椎脱臼法处死小鼠,取小鼠肝脏1小块,提取总RNA,检测肝脏TPO m RNA水平,同时取小鼠骨髓,应用石蜡包埋及免疫组化方法观察骨髓巨核细胞数量及形态变化。2.低剂量辐射对巨核细胞的增殖、分化及血小板生成及对吉西他滨引起的血小板减少的保护作用的研究(1)通过WST-1实验检测不同剂量X线辐照后巨核细胞增殖率的变化。(2)通过CD41-FITC/PI双染、CD41-FITC/CD61-PE双染流式细胞术检测LDR作用后巨核细胞多倍体形成、巨核细胞分化指标(CD41+/CD61+)的变化。(3)应用活细胞工作站的活细胞微分干涉相差显微镜观察LDR作用后的巨核细胞产生前血小板的过程的影响,并制作视频。应用光学显微镜观察并计数LDR作用后的正在产生前血小板的巨核细胞的数量的变化。(4)将6-8周SPF级雄性C57BL/6小鼠分为对照组、低剂量辐照组(100m Gy)、单纯吉西他滨组(Gem 200 mg/kg),低剂量辐照后序贯吉西他滨组(提前24h 100 m Gy+Gem 200 mg/kg),小鼠眼眶静脉取血法,应用小鼠五分类血球仪进行血细胞计数,观察小鼠血小板计数的变化情况并绘制曲线。结果:1.吉西他滨可抑制巨核细胞的增殖、多倍体形成及分化成熟,但无诱导凋亡WST-1法检测巨核细胞的增殖活性,在剂量效应研究中,我们发现:与对照组相比,0.1-1μM的吉西他滨能够明显抑制巨核细胞的增殖,呈剂量依赖性。在时间效应研究中,我们发现:与对照组比较,吉西他滨作用后24-96 h细胞增殖抑制率明显增加,呈时间依赖性,96 h细胞增殖抑制最明显。流式细胞术检测巨核细胞多倍体形成,结果发现:与对照组相比,0.1μM和0.5μM吉西他滨均能抑制巨核细胞的多倍体形成,使16倍体、32倍体和64倍体的巨核细胞所占的比例减少,而4倍体和8倍体巨核细胞所占的比例增多;并且0.1μM和0.5μM吉西他滨组的平均倍体数也显著减低。流式细胞术检测巨核细胞CD41+/CD61+表达率,结果发现:与对照组相比,0.1μM和0.5μM吉西他滨均能抑制巨核细胞的CD41+/CD61+的表达,0.5μM吉西他滨组的巨核细胞的CD41+/CD61+的表达率减低更为显著。流式细胞术检测巨核细胞凋亡率,结果发现:对照组巨核细胞正常分化成熟过程中伴随细胞凋亡的发生,0.1μM和0.5μM吉西他滨组的细胞凋亡率较对照组无明显差异。2.吉西他滨可抑制巨核细胞生成前血小板和血小板释放的过程应用活细胞工作站的活细胞微分干涉相差显微镜观察巨核细胞产生前血小板的过程,并应用光学显微镜观察并计数正在产生前血小板的巨核细胞的数量,结果发现:与对照组相比,吉西他滨0.1μM组和0.5μM组的巨核细胞产生前血小板和血小板释放均受到抑制。3.吉西他滨可抑制转录因子GATA-1、NF-E2、Fli-1的表达,促进细胞周期相关蛋白的基因p21、Cyclin D1、Cyclin E1的表达应用实时荧光定量PCR方法(q PCR)检测GATA-1、NF-E2、Fli-1、p21、Cyclin D1、Cyclin E1基因表达的情况。结果发现:与对照组相比,吉西他滨0.5μM组的转录因子GATA-1、NF-E2、Fli-1基因表达显著减低,而细胞周期相关蛋白基因p21、Cyclin D1、Cyclin E1基因表达不同程度升高,0.1μM吉西他滨组也有此趋势,但无统计学差异。4.吉西他滨作用后LC3、p-P38蛋白表达增加,p-AKT蛋白表达降低,而p-ERK1/2表达无明显变化应用Western-blot法检测p-ERK1/2、p-p38 MAPK、p-AKT、LC3的蛋白表达变化。结果发现:与对照组相比,吉西他滨0.1μM和0.5μM组的p-p38、LC3蛋白表达升高,p-AKT蛋白表达降低,而p-ERK蛋白表达水平无明显变化5.吉西他滨可诱导小鼠血小板减少,但血小板寿命不受影响小鼠分为溶剂对照组(生理盐水组)和吉西他滨给药组,每日连续监测血小板,结果发现:与对照相比,吉西他滨可明显诱导小鼠血小板逐渐减少,大约给药后第7-8 d降至最低,第10-11 d恢复近正常水平,第13-14 d反弹性升高,第16-17 d逐渐恢复至正常水平。应用流式细胞仪检测和分析CD41+/Biotin+的血小板的比例,连续检测5 d,根据CD41+/Biotin+的血小板衰减的比例计算出血小板的寿命。结果发现:与对照组相比,吉西他滨虽然影响小鼠体内血小板计数,但并不影响小鼠体内血小板的寿命,血小板寿命大约为5 d。6.吉西他滨作用后血小板数最低时,小鼠肝脏TPO m RNA水平降低,而血清中TPO、SDF1和IL-1水平升高,骨髓中巨核细胞数量减少,体积减小小鼠分为溶剂对照组(生理盐水组)和吉西他滨给药组,每日连续监测血小板,待血小板降至最低时,处死小鼠,应用q PCR方法检测小鼠肝脏TPO m RNA水平,Elisa方法检测血清中TPO、SDF-1和IL-1水平,HE染色观察并计数骨髓巨核细胞。结果发现:与对照组相比,吉西他滨组小鼠肝脏TPO m RNA水平降低,而血清中TPO水平增高,血清SDF-1和IL-1水平升高;小鼠骨髓中巨核细胞数量减少、体积减小。7.LDR可促进巨核细胞增殖WST-1法检测巨核细胞的增殖活性,在剂量效应研究中,结果显示:与对照组相比,25-100 m Gy的X线可促进巨核细胞增殖,其中75 m Gy促进增殖的效应最为明显;而当辐射剂量超过200 m Gy时,巨核细胞增殖受到显著的抑制。在时间效应研究中,结果显示:与对照组比较,低剂量辐照75 m Gy后24-96 h细胞增殖明显增加,24 h细胞增殖最明显,48-96 h增殖不再继续增加。8.LDR可促进巨核细胞多倍体形成及分化成熟应用CD41-FITC/PI双染流式细胞术检测LDR对巨核细胞多倍体形成,结果发现:与对照组相比,75 m Gy可促进巨核细胞的多倍体形成,使16倍体、32倍体的巨核细胞所占的比例增加,而2倍体、4倍体和8倍体巨核细胞所占的比例减少,平均倍体数增加。应用CD41-FITC/CD61-PE双染流式细胞术检测LDR对巨核细胞CD41+/CD61+表达率。结果发现:与对照组相比,75 m Gy X线可促进巨核细胞的CD41+/CD61+的表达。9.LDR可促进巨核细胞生成前血小板及血小板释放应用活细胞工作站的活细胞微分干涉相差显微镜观察巨核细胞生成前血小板的动态过程同时应用普通光学显微镜观察产生前血小板的巨核细胞并统计数量,结果发现:与对照组相比,LDR2组(75 m Gy第0 h+75 m Gy第96 h)的巨核细胞生成前血小板和血小板释放有所增加,而LDR1组(75 m Gy第0 h)组的巨核细胞前血小板生成及血小板释放无影响。10.LDR可减轻化疗药物吉西他滨引起的血小板减少的程度将小鼠分为对照组、低剂量辐照组(100 m Gy)、单纯吉西他滨组(Gem 200mg/kg),低剂量辐照后序贯吉西他滨组(提前24 h 100 m Gy+Gem 200 mg/kg),每日监测各组血小板计数。结果发现:与对照组比较,吉西他滨组的血小板减低程度最严重,低剂量辐照后序贯吉西他滨给药组,血小板减低程度有所减轻,而低剂量辐照组与对照组血小板数无明显差异。结论:1.吉西他滨可抑制巨核细胞增殖、分化成熟以及血小板生成和释放,但不诱导凋亡;2.吉西他滨可抑制巨核细胞转录因子GATA-1、NF-E2和Fli-1的表达,促进细胞周期相关蛋白的基因p21、Cyclin D1、Cyclin E1的表达;3.吉西他滨作用后LC3、p-P38蛋白表达增加,p-AKT蛋白表达降低,而p-ERK1/2表达无明显变化。4.吉西他滨可诱导小鼠血小板减少,但血小板寿命不受影响;5.吉西他滨作用后血小板数最低时,小鼠肝脏TPO m RNA水平降低,而血清中TPO、SDF-1和IL-1水平升高,骨髓中巨核细胞数量减少,体积减小;6.LDR可促进巨核细胞增殖、分化成熟、多倍体形成以及血小板生成和释放;7.LDR可减轻化疗药物吉西他滨引起血小板减少的程度而发挥保护作用。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R730.5;R558.2
【部分图文】：
4图 2.1 巨核细胞发育和血小板生成Figure 2.1 Megakaryocyte development and platelet production
巨核细胞的核内有丝分裂
图 2.3 TPO 与巨核细胞发育Figure 2.3 TPO and megakaryocyte developmentTPO 是巨核细胞发育过程发挥最重要的作用的细胞因子，除此之外，还有
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2821836
