Pak4对人食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制探讨

发布时间：2020-09-22 15:57

　　 目的据2017年中国肿瘤登记年报显示全国每天约1万人确诊为癌症,每分钟约7人确诊患癌。死亡率排前的癌症主要是肺癌和消化系统癌症。食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一,显著的地域性分布差异是其流行病学的突出特征。中国是世界上食管癌发病率和病死率最高的国家,又以食管鳞癌最为常见。河南省是中国食管鳞癌的高发地区,发病率高,死亡率高,严重威胁着人民的生命健康。食管鳞癌的相关问题厄待解决!食管鳞癌的发病原因多种多样,它的发生机制也是错综复杂,有许多研究发现它与多种信号通路的激活有关,但其具体的发生发展机制现在尚不清楚。众所周知人体的生命活动需要众多信号通路的参与来共同调控细胞生长、细胞分化、细胞迁移、骨架重排等。据多篇研究显示,Paks位于这些信号通路的结点处,具有多重生物学作用。Paks是p21激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,能够被小G蛋白Rho家族中的Rac1和Cdc42所激活,具有六个家族成员。在这六个家庭成员中,Pak1和Pak4是研究最多的。据多篇研究显示,Pak1和Pak4在许多肿瘤组织中均是高达的,并且Pak4是Paks中与人类肿瘤关系最为密切的成员,在已检测过的100多种人类肿瘤细胞中,有多达78%的细胞高表达Pak4。人类pak4基因定位于染色体19q13.2,长度为3064bp,一共编码591个氨基酸,其相对分子质量为72000Da。和其他家族成员不同的是,Pak4在胚胎和成体组织中广泛表达。它可以通过自身磷酸化、被外源性蛋白激酶磷酸化、甲基化等方式被活化。研究显示,Pak4可参与Pak4/MEK/ERK、Pak4/PI3K/AKT/m TOR、Pak4/LIMK1/confilin等多条信号通路,从而调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,影响肿瘤的发生、发展和预后。多项研究显示,Pak4在乳腺癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌等多种癌症中均起到重要调控作用,但是Pak4在食管鳞癌中的作用及其作用机制现在还不清楚。本研究将通过采用人食管鳞癌组织芯片以及不同种类的人食管鳞癌细胞株,研究Pak4和p-Pak4在食管鳞癌组织和食管鳞癌细胞中的表达;通过小RNA干扰实验和c DNA转染实验,研究Pak4对食管鳞癌细胞增殖,迁移和侵袭的影响;通过体内裸鼠成瘤实验进一步明确Pak4在食管鳞癌发生发展的作用,并用western blotting探讨Pak4在食管鳞癌细胞增殖和侵袭中的作用机制,为Pak4作为临床食管鳞癌患者治疗的新靶标提供一定的实验基础和理论依据。第一部分:探讨Pak4和p-Pak4在食管鳞癌组织和细胞中的表达方法1.利用免疫组织化学的方法检测Pak4以及p-Pak4(S474)在食管鳞癌组织中的表达情况。2.利用western blotting来检测正常食管上皮细胞和食管鳞癌细胞株中Pak4以及p-Pak4(S474)的表达情况。结果与正常食管组织和食管上皮细胞相比,Pak4和p-Pak4在食管鳞癌组织和大多数食管鳞癌细胞中均是高表达的。第二部分:探讨Pak4表达降低对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响方法1.构建七个包含不同pak4 sh RNA序列的PLKO.1载体。2.利用病毒感染的方法,敲低Pak4表达量相对较高的ECA109和Kyse450两种食管鳞癌细胞株中Pak4的表达,利用western blotting鉴定稳转株中Pak4的敲低效率。3.利用细胞增殖实验来探讨Pak4表达降低后,食管鳞癌细胞增殖能力的变化。4.利用软琼脂克隆形成实验来研究Pak4表达降低后,食管鳞癌细胞克隆形成能力的变化。5.利用细胞划痕实验来探讨Pak4表达降低后,食管鳞癌细胞迁移能力的变化。6.利用Transwell侵袭实验来证明Pak4表达降低后,食管鳞癌细胞侵袭能力的变化。结果Pak4参与食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程,Pak4表达降低会抑制食管鳞癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力。第三部分:探讨Pak4表达升高对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响方法1.利用转染的方法把pak4的c DNA转染进Pak4表达量相对较低的Kyse30和Kyse150两种食管鳞癌细胞株中,再次利用western blotting鉴定Pak4过表达稳转株是否建立成功。2.利用细胞增殖实验来探讨Pak4表达增加后,食管鳞癌细胞增殖能力的变化。3.利用软琼脂克隆形成实验来研究Pak4表达增加后,食管鳞癌细胞克隆形成能力的变化。4.利用细胞划痕实验来探讨Pak4表达增加后,食管鳞癌细胞迁移能力的变化。5.利用Transwell侵袭实验来证明Pak4表达增加后,食管鳞癌细胞侵袭能力的变化。结果Pak4表达增加,食管鳞癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和侵袭能力均增高,Pak4参与食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程。第四部分:用体内实验验证Pak4在食管鳞癌中的作用方法根据前期实验结果,选择ECA109-shmock、ECA109-shpak4-1和ECA109-shpak4-2三种稳转细胞株进行裸鼠成瘤实验,观察Pak4降低后,裸鼠瘤重和瘤体积的变化。结果ECA109-shmock的成瘤时间为4天,ECA109-shpak4-1和ECA109-shpak4-2的成瘤时间分别为9天和6天;与ECA109-shmock相比,ECA109-shpak4-1和ECA109-shpak4-2的瘤重小,瘤体积也小,差异有统计学意义(p0.05)。第五部分:探讨Pak4影响食管鳞癌增殖和侵袭的作用机制方法用western blotting实验来初步探讨Pak4影响食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制。结果Pak4通过参与ERK,AKT和EMT信号通路影响食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。结论1.相比较正常食管组织和正常食管上皮细胞,Pak4和p-Pak4在食管鳞癌组织和食管鳞癌细胞中均是高表达的。2.Pak4促进食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其作用可能是通过ERK、AKT和EMT信号通路的调控实现的。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.1
【部分图文】：

17图 1.1 Pak4 及 p-Pak4 在食管组织中的表达情况及结果分析比例尺为 50μm，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。2 Pak4 以及 p-Pak4 在食管鳞癌细胞株中是高表达的将收集的细胞从-80℃冰箱中取出冰上溶解，加入适量裂解液提取蛋 Western blotting 验证不同来源的食管鳞癌细胞株中 Pak4 及 p-Pak4 的表达

Westernblotting检测不同来源的食管鳞癌细胞株中Pak4及p-Pak4（S474）的表

3 实验结果3.1 PLKO.1-shpak4 载体的构建选用 PLKO.1 作为载体，在载体上连接 pak4 的 shRNA 序列，连接成功后对构建的载体进行酶切鉴定和测序鉴定。结果如图 2.1 所示，7 个序列在酶切之后均出现了 2kb 和 5kb 两个片段，说明 shRNA 序列连接的位置是正确的。测序结果（仅呈现其中两个序列）显示构建的载体中包含着 pak4 的 shRNA 序列，说明连接的顺序是正确的。由酶切鉴定和测序鉴定的结果可知，PLKO.1-shpak4 载体构建成功。

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 云扬;陈洁;陈飞飞;;Pak4的生物学特性及其与肿瘤的相关性研究[J];亚太传统医药;2011年09期

2 ;Angiopoietin-1 targeted RNA interference suppresses angiogenesis and tumor growth of esophageal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2008年10期

本文编号：2824604