Nogo-B受体促进激素受体阳性乳腺癌细胞他莫昔芬耐药性的形成

发布时间：2020-09-25 11:28

　　 背景:乳腺癌发病率在全世界女性肿瘤患者中居首位,且发病率正在逐年递增。这些乳腺癌患者中有75%为雌激素受体阳性患者。此类患者术后按疗程接受内分泌治疗可以有效增加其无病生存期和总生存期。根据NCCN指南建议,绝经前的激素受体阳性乳腺癌患者术后应服用他莫昔芬5-10年。尽管他莫昔芬对绝经前激素受体阳性乳腺癌患者疗效显著,仍有30%患者对他莫昔芬产生耐药,表现为在治疗期间或治疗结束发生复发转移的情况。目前,对他莫昔芬耐药的形成机制研究结论不一,主要的研究方向集中于:雌激素受体自身表达下调或其结构功能发生改变;生长因子及其下游通路过度激活;雌激素受体与生长因子通路之间的交互作用;细胞自身能量代谢的改变;DNA损伤修复异常等。Nogo蛋白,是网状蛋白家族中重要组成部分,包括Nogo-A,Nogo-B和NogoC三个亚型。其中,Nogo-B广泛分布于外周组织。Ng BR是Nogo-B氨基端的特异性受体(Am Nogo-B),可分布于肝、脑、肾、乳腺等多种组织器官中,对血管增生、细胞凋亡等多种生物活动产生影响,并且可以影响肝癌细胞对细胞毒性药物的敏感性。研究表明,Ng BR可以与Ras蛋白结合,使其活化,并稳定在细胞膜上,促进下游酪氨酸激酶介导的信号通路激活,促进肿瘤生长。Ng BR在激素受体阳性的乳腺癌中表达水平升高,且其表达水平与凋亡抑制基因survivin表达正相关。此外,Ng BR还可以通过促进乳腺癌细胞上皮-间质转化影响肿瘤细胞增殖、分化。乳腺癌上皮间质转化也是他莫昔芬耐药性形成的原因之一。然而,Ng BR对他莫昔芬耐药性的形成的是否存在影响及作用机制尚不清楚。目的:本研究通过对比Ng BR在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞MCF-7、T47D及其他莫昔芬耐性细胞中的表达变化,证明Ng BR对他莫昔芬耐药性的影响,并通过Ng BR与EGFR和ERα相互作用探究他莫昔芬耐药性形成的机制。方法:1、通过集落形成实验及CCK-8细胞增殖实验验证MCF-7和T47D耐药细胞的耐药性,并对比耐药细胞与非耐药细胞关键因子的表达变化2、通过si RNA沉默Ng BR基因,并采用流式细胞术、集落形成等技术检测耐药细胞对他莫昔芬敏感性的改变。3、通过si RNA沉默抑癌基因p53,检测Ng BR及survivin的变化以及沉默p53和survivin对他莫昔芬敏感性的影响。4、通过GEO数据库获取Ng BR、p53相应基因NUS1、TP53的RNA表达水平,并分析Ng BR与p53之间的关系。5、通过si RNA沉默Ng BR,用western blot技术检测ERα和EGF及其下游信号通路磷酸化水平的变化。并通过免疫沉淀技术检测Ras活性及Ng BR作用机制。6、对激素受体阳性的乳腺癌患者乳腺组织石蜡切片进行染色,检测Ng BR、Nogo-B和survivin表达含量的关系。7、通过KMPLOT网站获取激素受体阳性的乳腺癌患者生存信息,通过生存分析探究Ng BR对激素受体阳性的乳腺癌患者预后的影响。结果:1、通过集落形成试验和CCK-8证明,MCF-7-Tam R和T47D-Tam R对4-OHT敏感性降低。q PCR结果显示MCF-7-Tam R中Ng BR的m RNA水平高。Western blot结果显示与MCF-7和T47D相比,耐药细胞中Ng BR和survivin水平升高,p53、ERα水平降低。2、通过流式细胞技术、台盼蓝染色和集落形成实验证明,敲除Ng BR后MCF-7-Tam R和T47D-Tam R对4-OHT处理敏感性增加。3、通过western blot证明MCF-7-Tam R敲除Ng BR后,p53上调,survivin下调。流式细胞试验结果表明MCF-7细胞敲除p53后对4-OHT敏感性降低;敲除MCF-7-Tam R中survivin后,对4-OHT敏感性增加。T47D-Tam R也可得出相似结论。4、通过GEO数据检索得到60例乳腺癌患者NUS1和TP53的m RNA表达水平,分析后得知二者表达关系为负相关。5、通过western blot证明敲除Ng BR会减弱EGFR及其下游信号通路AKT、ERK、MDM2以及ERα磷酸化,并影响EGF对survivin表达的促进作用。免疫沉淀室验证明Ng BR通过激活Ras的活性,诱导EGF及其下游信号通路磷酸化。6、通过对22例乳腺癌患者石蜡切片进行免疫组化染色分析,得知survivin表达与Ng BR呈正相关。7、通过kmplot网站收集激素受体阳性(n=755)以及经过内分泌治疗的激素受体阳性(n=335)乳腺癌患者信息,分析后得知Ng BR高表达的患者,其无复发生存时间较短。结论:1、Ng BR在他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞中表达升高;2、Ng BR可通过survivin和p53影响他莫昔芬耐药细胞的增殖、凋亡;3、Ng BR敲除可影响EGF及其下游信号通路和ERα磷酸化,并影响耐药细胞生长;4、Ng BR高表达的患者预后较差。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

在生存率方面，城市及农村5年生存率分别为77.85和55.9%，存在较大差异。图1.1 世界范围内预计新发肿瘤及死亡率预测[1]（对比不同性别及经济发展水平）。

图 1.2 乳腺癌内分泌治疗 NCCN 指南.2 他莫昔芬的耐药机制他莫昔芬自从 1970 年发现至今，临床上一直是治疗雌激素受体阳性的绝乳腺癌患者的内分泌治疗首选[31]，可以显著降低该类患者的复发死亡率（如.3）。尽管他莫昔芬毒性较低，但也会发生一定的不良反应，比如潮热、阴道不增加、诱发子宫内膜癌等。

可以显著降低该类患者的复发死亡率（如图1.3）。尽管他莫昔芬毒性较低，但也会发生一定的不良反应，比如潮热、阴道分泌不增加、诱发子宫内膜癌等。图 1.3 他莫昔芬治疗 5 年可显著降低 ER 阳性乳腺癌患者复发及死亡率[32]。1.2.1 他莫昔芬的功能及代谢途径他莫昔芬是药物代谢的前体，与其作用靶点雌激素受体 ER 结合较弱。在肝

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本文编号：2826620