基于芯片数据对肾癌转移和非转移的生物网络分析及代谢通路分析

发布时间：2020-09-28 15:23

　　肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是我国泌尿系统肿瘤中发病率仅次于膀胱癌的恶性肿瘤,约占所有恶性肿瘤发病率的3%。受生活环境变化和诊断手段的提高影响,近年来国内外肾细胞癌发病率均呈现明显的增长趋势,已经成为威胁人类健康的最重要杀手之一。肾透明细胞癌是肾细胞癌的重要组成部分,约占所有肾细胞癌总发病率的70-80%。到目前为止,肾细胞癌的治疗仍以传统手术和放化疗等治疗手段为主,但由于肾细胞癌发病隐匿和诊断手段受限等影响,大部分患者就诊时已到了肾细胞癌的中晚期并伴有不同程度的转移,手术后易出现转移和复发,患者预后效果较差。免疫疗法是治疗终末期肾细胞癌的重要辅助手段之一,但受该手段应答灵敏度较小且具有一定的细胞毒性的限制,其临床应用效果并不太理想。因此深入研究肾细胞癌及其转移的分子机制,优化肾细胞癌治疗方案并开发肾细胞癌治疗的新靶向药物已经成为临床工作的研究热点之一。本研究利用公共数据库对已有的转移性和非转移性肾透明细胞癌肿瘤样本芯片表达谱数据,采用生物信息学方法筛选肾透明细胞癌肿瘤转移相关的特异性差异表达基因,并对这些基因进行功能注释和生物学功能分析。同时,通过分析差异表达基因编码蛋白之间的相互作用来构建蛋白与蛋白间相互作用的网络及与相关小分子药物相互关联分析,为肾透明细胞癌的临床诊断和药物控制治疗提供一定的数据支持。首先,通过GEO数据库下载GSE47352(包括4个早期转移和5个未转移肾透明细胞癌样本)和GSE22541(包括44例转移和24例未转移的肾透明细胞癌组织样本)的芯片数据,采用R语言limma包中的t检验根据基因表达差异筛选转移和未转移肿瘤组织样本中的差异表达基因。本研究中,在GSE47352数据集中共筛选得到359个差异表达基因,包括196个上调和163个下调基因。同时,在GSE22541进行差异基因筛选后共得到2623个差异表达基因,包括847个上调和1776个下调基因。然后,根据差异表达基因表达值进行聚类分析,再通过通路和功能分类对筛选的差异表达基因潜在的生物学功能进行进一步的研究,并根据基因重要的功能和通路构建差异表达基因编码蛋白的相互作用网络,同时通过Cmap搜索与疾病密切关联的药物小分子。最后,在细胞水平上对验证的基因进行生物学功能的进一步分析。对GSE47352芯片中筛选得到的差异表达基因进行信号通路分析后共显著富集到5条信号通路,其中肾细胞癌是最显著富集的通路,富集的相关基因包括EPAS1、ETS1、JUN、SOS2、TGFB2和PTPN11。蛋白互作网络分析发现JUN(连接度=6)有可能是蛋白相互作用的中心节点。药物小分子的分析结果显示,毒胡萝卜内酯对肾透明细胞癌具有非常高的抗癌作用。同时,对GSE22541中的差异表达基因进行功能及信号通路分析发现,上调基因主要显著富集在细胞外基质受体配体相互作用、癌症通路、黏着斑等相关通路上,而下调基因主要显著富集在神经因子信号通路、胰岛素信号通路和溶酶体信号通路。上、下调蛋白的蛋白相互作用分析结果发现,ITGA2、CDK1、COL1A1、MMP2和DCN是上调蛋白互作网络中的核心蛋白,而TP53、AKT1、EP300、HSP90AB1及RELA是下调蛋白互作网络中的核心蛋白。为寻找具有代表性的差异表达基因,本研究对两组芯片筛选的差异表达基因进行分析,取其共有的差异表达基因进行分析。结果共筛选到7个共有的上调表达基因和12个共有的下调表达基因。功能聚类分析后其主要集中在肌肉器官发展中的方面,而无显著的信号通路富集。最后,采用实时定量PCR对共有的差异基因表达情况在临床肿瘤组织样本和细胞水平上进行验证。结果发现,与非转移的原发性肾透明细胞癌组织相比,GPRC5A、RAB25、SGCD和KRT7的表达水平在转移性肾透明细胞癌组织中显著提高;同时,SLC6A19、SULT1C4、NFKBIL1和INF的表达水平在转移性肾透明细胞癌组中显著降低,与生物信息学的分析结果一致。同时,在细胞水平上我们也发现,SGCD和KRT7在癌细胞系CAKI中的表达水平显著高于正常肾细胞系,而SULTIC4的表达水平则显著低于正常肾细胞系。敲低KRT7的表达水平则能够显著抑制CAKI细胞的迁移能力。总而言之,本研究通过对比两组转移和未转移的原发性肾透明细胞癌的组织芯片中基因表达情况,发现了19个共有的差异表达基因,并对其进行验证发现,GPRC5A、RAB25、SGCD、KRT7、SLC6A19、SULT1C4、NFKBIL1和INF可能在肾透明细胞癌的转移过程中发挥重要作用。进一步细胞水平上的功能验证发现,敲低KRT7的表达能够显著抑制CAKI细胞的迁移能力,提示KRT7能够通过促进肾透明细胞癌的迁移而进一步促进癌细胞的转移过程。因此,深入研究这些基因在肾透明细胞癌转移过程中的分子机制,对于帮助和提高肾透明细胞癌的临床治疗具有重要指导意义。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.11
【文章目录】：
中文摘要
abstract
第1章绪论
    1.1 肾癌
        1.1.1 肾癌的流行病学
        1.1.2 病理生理学及遗传因素
        1.1.3 肾癌的诊断
        1.1.4 转移性肾癌治疗
    1.2 基因芯片数据的生物信息学分析
        1.2.1 数据预处理
        1.2.2 差异表达基因分析
        1.2.3 聚类分析
        1.2.4 生物信息学的研究意义
    1.3 本研究的目的与意义
第2章转移性肾透明细胞癌生物靶标识别
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 芯片数据来源
        2.2.2 芯片数据预处理
        2.2.3 差异表达基因筛选
        2.2.4 差异表达基因聚类分析
        2.2.5 差异基因功能、通路富集分析
        2.2.6 蛋白互作网络构建
        2.2.7 相关药物小分子的筛选
    2.3 结果
        2.3.0 差异表达基因筛选
        2.3.1 两种组织样本基因表达的差异程度比较
        2.3.2 差异基因功能、通路富集分析
        2.3.3 差异表达蛋白PPI网络的构建
        2.3.4 相关药物小分子的筛选
    2.4 讨论
第3章芯片数据的蛋白互作网络及代谢通路分析
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 表达谱数据获取
        3.2.2 表达谱数据预处理
        3.2.3 差异基因识别
        3.2.4 差异表达基因的功能富集分析
        3.2.5 差异基因的通路聚类分析
        3.2.6 蛋白质相互作用网络
        3.2.7 网络模块分析
        3.2.8 疾病相关miRNA的预测
        3.2.9 转录调控网络分析
    3.3 结果
        3.3.1 数据预处理
        3.3.2 差异表达基因筛选
        3.3.3 差异表达基因的功能富集
        3.3.4 差异表达基因的功能聚类分析
        3.3.5 重要通路展示
        3.3.6 蛋白质相互作用网络
        3.3.7 子网络模块分析
        3.3.8 miRNA-靶基因预测
        3.3.9 转录调控网络分析
    3.4 讨论
第4章两组芯片差异表达基因综合对比分析
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 两组差异基因的对比
        4.2.2 共有差异基因的功能分析
        4.2.3 共有差异基因的相互作用分析
        4.2.4 TF调控靶基因关系预测与网络构建
    4.3 结果
        4.3.1 两组差异基因的对比
        4.3.2 共有差异基因的功能分析
        4.3.3 共有差异表达蛋白的相互作用分析
        4.3.4 TF-靶基因关系预测
    4.4 讨论
第5章共有差异基因在转移和非转移人肾透明细胞癌组织中表达的验证
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 材料与试剂
        5.2.2 仪器与试剂
        5.2.3 实验方法
        5.2.4 RT-qPCR实验
        5.2.5 统计学分析
    5.3 实验结果
        5.3.1 上调差异表达基因验证
        5.3.2 下调差异表达基因验证
    5.4 讨论
第6章细胞水平验证差异表达基因的生物学功能
    6.1 引言
    6.2 材料与方法
        6.2.1 细胞株
        6.2.2 仪器与试剂
        6.2.3 实验方法
        6.2.4 统计学分析
    6.3 实验结果
        6.3.1 不同迁移能力细胞中基因表达的检测
        6.3.2 shKRT7对细胞增殖和迁移能力的影响
    6.4 讨论
结论
参考文献
作者简介及科研成果
致谢

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