ELF3通过调控miR-141-3p的表达来调控ZEB1诱导的肝癌细胞上皮间质转化的过程

发布时间：2020-09-30 20:56

　　背景肝癌是恶性程度最高的肿瘤之一,也是人类第三大致死性恶性肿瘤。尽管治疗肝癌的手段不断的进步,然而由于肝癌的易复发和转移肝癌的治疗效果并不理想。大量的研究表明,上皮间质转化(EMT)在肝癌发生和发展中起到重要的作用。ELF3是上皮转录因子家族中的成员之一,在多个病理生理过程中起到重要的作用,包括癌症和免疫系统紊乱。最近研究表明,ELF3在癌症细胞的增殖、分化、转移和侵袭过程中有重要作用。然而目前,ELF3在肝癌中是否起到促进作用目前未可知。微小RNA(miRNA)是由20-24个核酸组成的非编码RNA。众多研究表明miRNA在肿瘤的进展过程中起到重要的作用。ZEB1作为EMT中最为关键的分子之一,其在多个肿瘤中表现为抑制E-cadheim蛋白促进EMT发展的作用。目的ELF3是ETS转录因子家族中的一员,且在多种癌症的发生、发展、转移和侵袭中有重要的作用。然而,ELF3在肝癌中的作用却不清楚。因此,本次研究目的主要探究ELF3在肝癌中的表达情况及其在肝癌转移和侵袭的机制。方法用qPCR、Western Blot、免疫组化方法研究ELF3在肝癌的表达情况。研究ELF3的表达与患者临床病理资料,分析ELF3与患者临床病理特征及预后的相关性。通过病毒转染构建ELF3的过表达及敲减的稳定转染的细胞株。通过CCK-8、克隆形成、Transwell细胞迁移和侵袭实验以及裸鼠皮下成瘤和裸鼠体内脾脏注射-肝转移模型研究ELF3对肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。通过Western Blot及qPCR实验检测高表达及敲减ELF3细胞的EMT标志物。运用CHIP及Luciferase启动子实验研究ELF3调控E-cadherin的机制。最后用脾脏肝转移动物模型验证ELF3对肝癌的转移侵袭的作用。结果我们发现ELF3在肝癌中表达明显升高。对106例肝癌组织进行免疫组化分析,并结合肝癌患者的临床病理特征我们发现,ELF3的高表达与患者的肝癌肿瘤大小密切相关(p=0.048)。Kaplan-Meier生存分析结果发现,ELF3高表达的肝癌患者有着较差的总生存期和无瘤生存期。COX多因素分析发现,ELF3为肝癌患者总生存期和无瘤生存期的独立危险因素。通过对ELF3蛋白的敲减和过表达,我们发现当过表达ELF3后,肝癌细胞的增殖、转移和侵袭能力增强。相反,敲减ELF3蛋白后,肝癌细胞的增殖、转移和侵袭能力明显减弱。CHIP实验及Luciferase启动子实验结果表明,ELF3可以直接靶向调控miR-141-3p。裸鼠体内脾脏注射-肝转移模型结果表明,敲减ELF3蛋白的MHCC-LM3细胞组裸鼠体内肿瘤转移和侵袭要明显差于对照细胞组裸鼠。结论我们第一次发现,ELF3在肝癌组织和肝癌细胞中高表达。ELF3可以增强肝癌细胞的增殖、转移和侵袭的能力。ELF3通过靶向抑制miR-141-3P来促进ZEB1的表达,抑制E-cadherin的表达,从而促进肝癌的转移和侵袭能力。ELF3有潜力成为肝癌的预后和治疗靶点。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7
【部分图文】：

肝癌细胞株,情况,肝癌组织,肝癌细胞

逦正文结果逡逑图１．１邋ＥＬＦ３在肝癌组织中的表达。Ａ．邋ｑＰＣＲ检测正常肝组织和肝癌组织中ＥＬＦ３逡逑的ｍＲＮＡ水平的表达情况。Ｂ．Ｗｅｓｔｅｍ邋ｂｌｏｔ检测正常肝组织与肝癌组织中的ＥＬＦ３逡逑中的蛋白水平的表达。Ｃ．免疫俎化染色检测ＥＬＦ３表达，肝癌组织（Ｔ）与其癌旁逡逑组织（ＡＮＴ）中ＥＬＢ表达的典型图片（放大１００倍标尺为２００叫１，放大４００倍标逡逑尺为邋５０ｐｊｎ）。Ｄ．邋Ｒｏｅｓｓｌｅｒ邋ｌｉｖｅｒ邋及邋Ｒｏｅｓｓｌｅｒ邋ｌｉｖｅｒ２邋数据中邋ＥＬＦ３邋ｍＲＮＡ邋在肝正常组织逡逑及肝癌中的表达情况。（＊，邋ｐ＜0．0５；邋＊＊，邋ｐ＜０．０１，邋＊＊＊，邋ｐ＜０．００１）逡逑为了进一步检测ＥＬＦ３在肝癌细胞中的表达的情况，我们用Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ及逡逑ｑＰＣＲ检测ＭＨＣＣ－ＬＭ３、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２四株肝癌细胞中的ＥＬＦ３的表徶逡逑情况。结果显示ＭＨＣＣ－ＬＭ３中蛋白ＥＬＦ３表达最高，而Ｈｕｈ７细胞ＥＬＦ３表徶最逡逑低，且表达具有明显差异（图１．２）。逡逑５８－，邋一逡逑？邋＾逡逑ａｆｉ－逦＾逡逑？逦Ｏ逦＼邋Ｓｊ逡逑灥邋４．邋ＮＳ逦／邋／邋／邋＾逡逑’逦ＥＬＦ３邋｜逦？邋４２ＫＤ逡逑１逦＿＿邋丨了邋｜逦［逦１逦ＧＡＰＤＨ逦＾逦３７邋ＫＤ逡逑ｉｒ０逡逑Ｈｕｔｉ７邋ＨｅｐＧ２邋Ｈｅｐ３Ｂ邋ＭＨＣＣ－ＬＭ３逡逑图１．２邋ＥＬＦ３在四株肝癌细胞株中的表徶情况。ＱＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测肝癌细逡逑胞株中ＥＬＦ３的表达情况。（＊＊＊

预后,病理分期,生存分析

生存分析结果显示，ＥＬＦ３高表达的肝癌患者术后总的５年生存期要低于ＥＬＦ３低逡逑表徶的肝癌患者（ｐ＝0．0１３），同样的，ＥＬＦ３高表达的肝癌患者术后的无瘤生存期逡逑要低于ＥＬＦ３低表达的肝癌患者（ｐ＝０．０３３）（图２Ａ）。我们又对所有的病理分期Ｉ逡逑４３逡逑

过表达,细胞株,细胞,蛋白

对照细胞Ｈｕｈ７－ｃｏｎｔｒｏｌ的德定转染株。逡逑提取Ｈｕｈ７－ＥＬＦ３细胞反Ｈｕｈ７－ｃｏｎｔｒｏｌ细胞ＲＮＡ及蛋白分别行ｑＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑Ｂｌｏｔ实验验证。如图２．１所示，Ｈｕｈ７－ＥＬＦ３细胞的ＥＬＦ３在ｍＲＮＡ水平及蛋白水逡逑平都明显高于Ｈｕｈ７－ｃｏｎｔｒｏｌ细胞，ＥＬＦ３过表达细胞株构建成功。逡逑在邋Ｓ１００１逡逑＿７邋备建邋｜：２：逦＾—逡逑／邋／邋Ｂ逡逑ＥＬＦ３逡逑ＧＡＰＤＨ逦３７邋ＫＤ逦逦逡逑Ｈ邋ｕｈ７－ＥＬＦ邋３逦Ｈ邋ｕｈ邋７邋－ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑图２．１经ｑＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测，ＥＬＦ３过表达细胞株分别在ｍＲＮＡ和蛋白水逡逑平明显高于对照细胞。（＊＊＊，ｐ＜０．００１）逡逑４５逡逑

【参考文献】