ANKHD1通过调控YAP1及其磷酸化促进非小细胞肺癌细胞增殖

发布时间：2020-10-08 15:45

　　锚蛋白重复序列ANK是蛋白数据库中最常见的蛋白序列之一,在酵母和果蝇中首次确定的,具有33个氨基酸的序列重复12-24次。具有多个锚蛋白重复序列和一个单独的KH结构域的MASK蛋白是通过基因筛选的方法在果蝇中首次被发现的。MASK在人类中的的直系同源蛋白是ANKHD1(包含锚蛋白重复序列和一个KH结构域),过去曾经被命名为hMASK,于2003年是由Poulin等在前列腺癌细胞系LNCaP中发现的。ANKHD1蛋白的编码基因位于人类5号染色体长臂3区。所含有的锚蛋白重复序列表明了ANKHD1作为骨架蛋白的作用,主要可以介导蛋白之间的相互作用,是细胞周期控制、转录调节、分化、凋亡和细胞骨架组织等生物学过程的基础。KH结构域主要可以介导蛋白质与核酸之间的相互作用。ANKHD1(锚蛋白重复和KH结构域包含蛋白1),是一种在正常人类组织中普遍表达的蛋白,并且在某些癌症组织中高表达。ANKHD1主要位于细胞浆,也有研究发现其在细胞核中也有表达。有研究发现,在正常造血细胞和急性白血病细胞中定位于胞浆,细胞核中未见表达;在多发骨髓瘤的细胞系中胞浆和胞核中均有表达。因为其对P21有直接的调节作用,研究者猜测其存在着胞浆和胞核的转运而发挥作用,ANKHD1可以通过影响细胞周期相关蛋白而调节细胞周期,影响肿瘤细胞的增殖。十余年来,逐渐有学者研究ANKHD1在疾病中的作用,包括在多发骨髓瘤、急性白血病和前列腺癌等细胞系的研究。另有研究发现ANKHD1在果蝇和人类的Hippo通路中YAP1的激活起到了非常重要的作用。在果蝇的S2细胞系的体外研究中,研究人员发现沉默MASK的表达能够特异性的减低Yki的活性,并且在果蝇中组织的正常生长和Yki靶基因的表达是必要的。在体研究发现,蛋白Mask可以和蛋白Yki形成复合物的形式而发挥作用。应用探针的办法在乳腺癌病人的基因表达数据文件中检测MASK1mRNA的第一个锚蛋白重复序列,发现MASK1的表达水平较低的病人预后越好。后来又有学者在前列腺癌细胞系的研究中证明ANKHD1通过与YAP1结合,激活YAP1,通过调节CyclinA的表达从而影响肿瘤细胞生长和细胞周期的进展,沉默ANKHD1可以使得YAP1在mRNA和蛋白水平均下调。YAP1是Hippo信号通路的核效应因子,编码基因位在染色体11q13,其编码Yes相关蛋白YAP,YAP为65kda的蛋白,由1至2个WW结构域、羧基末端的PDZ结合序列、氨基末端富脯氨酸结构域、14-3-3蛋白结合位点及SH3结合基序构成。Hippo信号通路可被各种不同的上游信号激活,包括G蛋白偶联受体,细胞接触、细胞外基质、细胞极性及细胞粘附分子或连接蛋白等。在人类中,重要的Hippo信号通路的分子有Yes-associated protein1(YAP1),Large tumor suppressors 1 and2(LATS1/2),MammalianSTE-20 kinases1and2(MST1/2)和Msp-one-binder(MOB1),这些分子是进化保守的,并且在肿瘤的发生中起到抑制因子的作用。Hippo通路激活后,能够依次磷酸化激酶MST1/2,LATS1/2,而后者可磷酸化YAP1,YAP1丝氨酸磷酸化导致了细胞浆的隔离和降解。失活后,非磷酸化状态的YAP1激活,进入细胞核。然后,YAP1发挥转录激活因子的作用,能够与各种不同的转录因子结合如:ErbB4,p53,BP-2,RUNX2,TEAD1-4和p73,进而调节多种基因的表达、调控它们的转录活性,但其自身并没有转录活性。目前的研究表明,ANKHD1在细胞功能相关的信号通路中可能有很多作用,如转录调节、细胞周期调控和细胞生存。至今,尚未有ANKHD1在非小细胞肺癌中的表达对预后的影响相关研究,本研究的目的旨在探索ANKHD1是否通过影响YAP的表达进而影响Hippo通路的活性而影响非小细胞肺癌的恶性表型的。材料与方法一、患者信息和样本本实验根据中国医科大学伦理委员会监督下进行。在中国医科大学附属第一医院搜集170例(1999年-2006年)非小细胞肺癌及30例对应的癌旁正常肺组织(距肿物边界大于5cm)标本,所有标本来源的患者均接受肺癌手术但没有接受过术前放化疗治疗,而且具有完整的随访资料,随访从手术之日起到随访结束日期或由于复发、转移而死亡之日止。其中男性为94例,女性为76例。根据WHO2015肺癌组织学分类标准和2010年国际抗癌联盟TNM分期标准进行重新评估。二、Cell linesHBE细胞系从ATCC(Manassas,VA,USA)细胞库获得。LK2购买于JCRB细胞库(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank),PG-LH7(LH7)、BE1是来自北京大学zheng jie教授的友好惠赠,A549、H1299、SPC-A-1(SPC)和LTEP-A-2(LTE)购于上海细胞库所有细胞系都用含10%的小牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)及100U/mL的青链霉素(Sigma,St.Louis,MO,USA)的RPMI 1640培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)并置于37°C,5%浓度的CO2细胞培养箱中培养。三、免疫组织化学将选取的病理标本的蜡块制备成4微米厚的切片。切片经二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水,抗原修复步骤后,染色采用S P系统(KIT-9710,Ultrasensitive TM S-P,MaiXin,China),利用ANKHD1(1:100;Abcam,ab199164)抗体进行染色。空白对照组以PBS代替一抗。生物素标记的二抗(Ultrasensitive;MaiXin,Fuzhou,China)37℃孵育30分钟,DAB显色。在每张切片上,随机选5个视野,每个视野都进行计数约500个细胞。然后依据所计数的细胞着色的百分比,将表达ANKHD1的细胞数目进行划分,五个等级分别为:0分(无细胞着色),1分(1-25%的细胞着色),2分(26-50%的细胞着色),3分(51-75%的细胞着色),4分(76%以上的细胞着色)。依据细胞着色的强度,我们将ANKHD1的表达划分成4个等级:0分(无着色),1分(浅黄色颗粒),2分(黄色颗粒),3分(深黄色或者黄褐色颗粒)。每张切片的最终得分为:切片细胞数目等级评分与着色分数等级评分的乘积。将得分小于2判为阴性,而将得分大于或等于2以上判为阳性。四、Western Blot应用胰酶消化并收集培养瓶或培养皿中成指数生长的细胞后,加入裂解液(Pierce,Rockford,IL,USA)进行充分裂解,并利用超声使蛋白裂解更完全,冰上静置5分钟,放入提前4℃预冷处理的离心机离心10分钟,提取其总蛋白,然后用考马斯亮蓝进行浓度测定,并定量,加入6Xloading buffer,沸水煮样5分钟。上样,通过6%浓度的SDS-PAGE进行蛋白电泳,电泳结束后,将蛋白转印到PVDF膜上。将膜放入5%脱脂奶粉内室温摇床封闭1小时,加入ANKHD1(Abcam,ab1177881:500)LATS1(Cell Signaling Technology,#9153,1:1000);p-YAP(Cell Signaling Technology,#4911,1:1000);YAP(Cell Signaling Technology,#4912,1:1000);MST1(Cell Signaling Technology,#3682,1:1000/IB);CTGF(Santa Cruz Technology,sc-14940,1:100)GAPDH(Sigma#G8795;1:2000 IB);4℃过夜。分别加入山羊抗兔,或抗鼠的二抗(1:5000,Santa Cruz Biotechnology,Inc.CA,USA)后,37℃孵育1小时。TTBS洗膜后,ECL发光。五、质粒构建与转染干扰pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1质粒购自Origene公司(RC221886,Rockville,MD,USA)siRNA-ANKHD1(Santa Cruz Technology,sc-92073),shRNA-ANKHD1(Santa Cruz Technology,sc-92073-SH),将质粒按照相关说明用Lipofectamine 3000Transfection Reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)转入细胞内,48h或72h后,利用Western blotting或实时定量PCR的方法检测相关蛋白和mRNA的表达。六、免疫荧光实验细胞经4%多聚甲醛固定,Triton X-100打孔,用5%BSA室温封闭1小时后,加入一抗ANKHD1(1:100;Abcam,ab199164),4℃孵育过夜,次日加入山羊抗兔/鼠二抗、罗丹明二抗避光孵育。细胞核采用DAPI染色,甘油封片,采用Radiance 2000荧光共聚焦显微镜(Carl Zeiss,Thornwood,NY,USA)采集图片。每一步染色之后均用PBS洗。七、MTT实验用胰酶消化转染或干扰24小时后的细胞,并制成单细胞悬液后吗,转入96孔板,每一个孔约移入3000个左右细胞,随后加入含10%的小牛血清的培养基培养24小时后,每孔加入20微升的5 mg/ml MTT(Thiazolyl Blue)溶液,保留只有培养液的对照孔。在37℃条件下,进行避光孵育,4小时后弃掉原溶液,加入150微升的DMSO溶解生成的MTT结晶,用分光光度计检测490nm波长的吸收峰值。本实验重复三次,并取平均值。八、基质胶侵袭实验采用一个24孔板,含有8μm微孔的Transwell小室(Corning,NY,USA),上室铺以双无的1640培养基按1:3的比例稀释的基质胶(BD Biosciences)。转染48小时后,100微升约含有5×10~5个细胞转移到不含血清的上室,孵育16小时,下室加入含有10%小牛血清的培养基,继续培养48小时,将表面细胞用棉签擦掉,将剩余细胞用预冷的4%甲醛固定,然后进行苏木素染色,1%盐酸酒精分化,返蓝10分钟。在显微镜下进行统计,具体方法为,随机选取10个视野计数侵袭到小室下的细胞数目。本实验重复三次,取平均值。九、集落形成实验将转染或干扰ANKHD1后的细胞,接种到6厘米细胞培养皿中(约1000个细胞/皿)孵育2周。用PBS洗涤后,吉姆萨染色、干燥,在显微镜下进行统计,计数超过50个细胞的克隆数。十、RNA提取和Real-time PCR使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)从细胞中提取总RNA。根据PrimeScript~(TM) RT Master Mix(TaKaRa,China)实验说明书,1微克RNA用于逆转录实验。Real-time PCR采用使用总量为20微升体系的SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)在7900实时定量PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)中完成。运行qRT-PCR反应板热循环反应为50℃2min,95℃10min,95℃40s,40个循环,然后60℃60s。GAPDH作为内参,基因表达的倍数改变采用2~(-ΔΔCt)方法计算,实验重复3次。实时定量PCR引物序列为:ANKHD1:5-AGACCAATCGGAACACGGCTCT-35-CAGAAGCTGCTTCCATCAAGGG-3YAP1:5-TGTCCCAGATGAACGTCACAGC-35-TGGTGGCTGTTTCACTGGAGCA-3GAPDH:5-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-35-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3十一、免疫共沉淀实验首先用预冷的PBS清洗细胞两遍,用NP-40裂解液冰浴5分钟后,将细胞裂解产物从培养皿中转移至新的EP管中,裂解产物在4℃条件下,16000g离心5分钟后,将上清转移至新管中,紫外分光光度计将蛋白定量,提取约200ug蛋白,加入足够量的抗体,4℃轻摇过夜,然后加入25 uL A/G蛋白磁珠(Beyotime,Jiangsu,China)4。C轻摇4h.然后将混合物1500×g 4。C离心5分钟,然后将上清去掉。将上一步骤所余沉淀物,用冰浴的RIPA缓冲液洗3次,加入样品缓冲液,在沸水中煮5min使免疫复合物与磁珠解离。然后收取免疫复合物进行Western blot检测。十二、动物实验20只BALB/c裸小鼠,4-6周龄,雌性,18-21g,从北京维通利华公司购买。于温度恒定,湿度恒定的半屏障系统中进行饲养,并且,裸鼠的饮用水和饲料都经过严格的灭菌处理。严格按照中国医科大学动物实验伦理条例,进行动物实验的实施。实验共分为4组(5只/组):分别为稳转空质粒的A549细胞组,稳转pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1的A549细胞组,稳转空质粒的SPC细胞组,稳转shANKHD1的SPC细胞组,调整各组细胞浓度至5×10~6个/ml,于裸鼠背部皮下注射0.2ml。从注射细胞的当天算起,进行连续观察,8周后统一处死,肿瘤称重后进行统计分析。十三、统计学分析将所有获得的数据采用SPSS软件19.0版本(SPSS,Chicago,IL,USA))进行统计学分析。Chi-Square检验ANKHD1表达与临床病理因素之间的关联。Kaplan-Meier法检测ANKHD1对患者生存时间的影响。其他结果的比较均采用t检验。p0.05则为有统计学意义。结果一、ANKHD1在非小细胞肺癌组织中表达上调1.在30例正常组织中,ANKHD1阳性表达为11例,阳性表达率为36.7%;阴性表达为19例,阴性表达率为63.3%。在170例非小细胞肺癌中,ANKHD1阳性表达为117例,阳性表达率为68.8%;阴性表达为53例,阴性表达率为31.2%.ANKHD1在肺癌中的表达明显上调(p=0.004)2.8对非小细胞肺癌组织和对应的癌旁正常组织进行Western Blot分析,检测ANKHD1蛋白表达情况。发现ANKHD1在肿瘤组织中的表达明显高于癌旁正常组织。二、ANKHD1的表达与非小细胞肺癌临床病理特征具有相关性ANKHD1的表达与患者年龄(p=0.615)性别(p=0.740)、组织学类型(p=0.743)、分化程度(p=0.188)和肿瘤大小(p=0.862)并无统计学关系;但是,ANKHD1的阳性表达与高的p-TNM分期(p=0.019)和淋巴结转移(p=0.020)有关。三、ANKHD1过表达与预后不良相关1.生存分析结果显示ANKHD1高表达的肺癌术后患者5年总体生存时间要低于ANKHD1阴性表达的患者(p=0.037),提示ANKHD1与患者预后相关;2.应用Cox线性回归分析肺癌患者危险因素,发现ANKHD1阳性表达和淋巴结转移是非小细胞肺癌患者的独立预后因素(p0.05,表3)。四、ANKHD1在非小细胞肺癌细胞系中发挥致癌因子作用在肺癌细胞系A549,SPC,H1299,LK2,LTE,BE1,LH7中,与正常人支气管上皮细胞系HBE相比,ANKHD1的mRNA和蛋白质水平呈高表达。在ANKHD1表达相对较低水平的细胞系A549中转染ANKHD1的质粒,在ANKHD1表达相对较高水平的细胞系SPC中干扰ANKHD1;并在48或72小时后检测转染和干扰效率。1.克隆形成实验结果表明,在A549细胞系中转染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1细胞克隆形成的数量显著升高。(转染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1与对照组相比:284±28 vs 140±20,p0.05))。在SPC细胞系中干扰ANKHD1的表达细胞克隆形成的数量显著降低。(对照组与ANKHD1siRNA组相比:186±41 vs 103±16,p0.05)。2.MTT实验:在A549细胞系中转染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1与对照组相比,增殖率增加;在SPC细胞系中干扰ANKHD1的表达,与对照组相比,增殖率降低。3.侵袭实验结果表明,侵袭实验结果表明,肺癌细胞系A549转染ANKHD1后侵袭细胞数相比于对照组明显增加(转染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1组vs对照组:134±5 vs 43±6,p0.05);肺癌细胞系SPC干扰ANKHD1后侵袭细胞数相比于对照组明显减少(对照组vs ANKHD1siRNA组:160±10 vs 61±6,p0.05)五、ANKHD1表达上调能促进裸鼠移植瘤的形成裸鼠成瘤实验显示在A549中转染ANKHD1,相比于对照组,肿瘤的重量显著增加(shRNA-ANKHD1 vs对照组:0.798±0.068 vs 0.330±0.052,p0.05);在SPC中干扰ANKHD1与对照组相比,肿瘤的质量降低显著(对照组vs siRNA-ANKHD1:0.712±0.062 vs 0.290±0.067,p0.05)。六、ANKHD1能够影响Hippo下游靶基因CyclinD1和CTGF的表达转染和干扰ANKHD1后对HIPPO靶基因表达的影响在A549细胞系中转染ANKHD1后,CTGF及Cyclin D1的表达上调;在SPC细胞系中干扰ANKHD1,CTGF及Cyclin D1的表达下调。七、ANKHD1通过调控YAP1的表达影响Hippo通路的活性1.ANKHD1、YAP1在细胞浆和细胞核中均有定位,ANKHD1主要定位于胞浆,YAP1定位于细胞核。2.ANKHD1与YAP1结合,并促进YAP1mRNA及蛋白水平的上调。3.在H1299细胞系中分别转染空质粒、pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1、空质粒与siYAP、pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1与siYAP,分别行克隆形成实验和基质胶侵袭实验,结果表明:ANKHD1能够促进细胞增殖(empty vector vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1:84±4 vs 180±9,p0.001),(empty vector+siYAP vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1+siYAP:43±7 vs 56±5,p0.05)和侵袭(empty vector vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1:68±4 vs 134±6,p0.05),(empty vector+siYAP vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1+siYAP:28±2 vs 34±2,p0.05),且这种作用是通过YAP实现的。结论1.ANKHD1在人类非小细胞肺癌中的表达上调,并与p-TNM分期、淋巴结转移及预后有显著的相关性2.ANKHD1能够促进非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭。3.ANKHD1能够影响Hippo通路下游靶基因的表达。4.ANKHD1通过调控YAP1及其磷酸化影响Hippo通路的活性促进细胞增殖、侵袭。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：

肺癌组织,肺组织,胞浆

图 1 ANKHD1 在肺癌组织和癌旁肺组织的表达和定位（400×）A. ANKHD1 在支气管上皮阴性表达B. ANKHD1 在肺泡上皮阴性表达C. ANKHD1 在肺腺癌组织胞浆阳性表达D. ANKHD1 在肺鳞癌组织胞浆阳性表达表 1 ANKHD1 在肺癌组织的阳性表达率高于癌旁肺组织的表达* p<0.05, indicate statistical significance3.1.2 我们又进一步采用 8 对非小细胞肺癌组织和对应的癌旁正常组织进行Western Blot 分析，检测 ANKHD1 蛋白表达情况。其结果与免疫组化结果一致NANKHD1P-valueNegative PositiveNormal 3019 (63.3%) 11 (36.7%)0.004Tumor 17053 (31.2%) 117(68.8%)

肺癌组织,蛋白表达,情况,临床病理特征

图 2 ANKHD1 在肺癌组织和癌旁正常肺组织的蛋白表达情1 的表达与肺癌临床病理特征具有相关性究 ANKHD1 在非小细胞肺癌组织中的表达上调是否具有达情况与临床病理因素之间的统计学关系。结果表明：A TNM 分期（p=0.019）和阳性淋巴结转移（p=0.020）呈.615）性别（p=0.740）、组织学类型（p=0.743）、分化程p=0.862）并无明显相关性（表 2）。

肺癌患者,非小细胞肺癌,患者,阴性

非小细胞肺癌患者 ANKHD1 阳性表达与阴性表达患ox 线性回归分析肺癌患者危险因素，发现 AN肺癌患者的独立风险因素。（表 3）表 3 Cox regression model 分析肺癌患者危险因athological Hazard ratiocteristics (95% CI)ate analysiser than 55 0.929 (0.652-1.323) er: male 0.941 (0.665-1.331) e : Adenocarcinoma 1.238 (0.875-1.752) ferentiation 1.155 (0.786-1.697) classification 0.993 (0.701-1.406) h node metastasis 1.797 (1.271-2.540) HD1 expression 1.698 (1.149-2.509) iate analysis

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