LINC00222通过调控GSK-3β影响非小细胞肺癌生物学行为的机制研究

发布时间：2020-10-23 04:01

　　 目的:肺癌是最常见的肿瘤相关性死亡原因,全球的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌病例的80-85%,大多数非小细胞肺癌患者诊断为晚期,因为他们在早期通常无明显症状,总体的5年生存率仍然是大约16%。因此,深入研究非小细胞肺癌的分子机制和特异性诊断标志物十分重要,有利于非小细胞肺癌的早期诊断及治疗。人类转录基因组不仅包含编码蛋白质的信使RNA(mRNA),而且还包含大量具有结构功能、调节功能或功能未知的不编码蛋白质的转录子。长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)是一类(长度大于200nt,蛋白质编码潜力有限的)非编码RNAs,lncRNAs已被证明在细胞生物学的各个方面扮演重要角色。一些lncRNAs已经证明在细胞发育、分化和许多其他生物学过程中发挥重要作用。此外,一些研究已发现lncRNAs在各种类型的人类疾病特别是癌症中出现失调。然而,尽管十多年的研究使得人们在了解lncRNAs上已经有了巨大的进步,但是大多数lncRNAs的具体的功能仍然是未知的。Wnt/β-catenin信号通路是已被公认的在调控肿瘤形成和转移发挥至关重要作用的信号通路,在人类非小细胞肺癌细胞株和组织中可检测到异常激活的Wnt信号占50%。越来越多的证据显示,lncRNAs是Wnt/β-catenin信号通路的重要调节器。糖原合酶kinase-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是Wnt/β-catenin信号通路的一种关键蛋白,可磷酸化β-catenin并导致其降解。这里我们首先检测长链非编码RNA-222(long intergenic non-protein coding RNA222,LINC00222)在非小细胞肺癌样本、相邻癌旁正常肺组织的表达情况,LINC00222已被证明在肝母细胞癌组织中低表达。过表达LINC00222可抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭,但可以诱导细胞凋亡。然后我们通过RPISeq软件(URL http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/results.php)预测到LINC00222可能与GSK-3β蛋白结合,进一步验证LINC00222如何通过GSK-3β来调控Wnt/β-catenin信号通路。我们的研究结果为非小细胞肺癌的治疗提供了一个新的思路。研究方法:1、实验材料:(1)非小细胞肺癌新鲜冰冻组织。(2)非小细胞肺癌A549、LTEP-a-2细胞系。(3)Real-time PCR实验所需试剂、仪器。(4)Western Blot实验所需试剂、仪器。(5)细胞培养相关试剂、仪器。(6)LINC00222表达载体:pCDNA-LINC00222。(7)GSK-3β活性抑制剂TWS119。(8)RNA-CHIP相关试剂、设备。2、实验方法:(1)Real-time PCR方法检测新鲜冰冻非小细胞肺癌组织及癌旁正常肺组织中LINC00222的RNA表达水平,检测非小细胞肺癌细胞系及正常肺胚细胞系中LINC00222表达。(2)将LINC00222表达水平与研究对象预后指标相关性进行分析,验证LINC00222表达是否与非小细胞肺癌预后相关。(3)构建LINC00222全长表达载体pCDNA-LINC00222,转染非小细胞肺癌细胞系A549、LTEP-a-2。(4)利用CCK-8、PI凋亡实验鉴定LINC00222在增殖、凋亡中的作用。(5)利用transwell、划线实验技术鉴定LINC00222在非小细胞肺癌细胞转移、侵袭种的作用。(6)利用Western Blot检测转染细胞GSK-3β磷酸化蛋白水平变化,鉴定GSK-3β活性是否改变。(7)利用Western Blot检测细胞核β-catenin蛋白表达,验证LINC00222能否影响β-catenin磷酸化而导致核转位异常;加入GSK-3β活性抑制剂(TWS119),鉴定β-catenin蛋白表达是否回调。(8)利用RNA-蛋白质免疫沉淀技术(RNA-CHIP,RIP)鉴定LINC00222是否可与GSK-3β蛋白直接相互作用。结果:1、相对于邻近的正常肺组织,LINC00222在85%(88/103)的非小细胞肺癌样本中明显低表达。2、相对于MRC-5细胞,LINC00222在A549和LTEP-a-2细胞中表达明显降低。3、LINC00222低表达组的患者有较高的复发率(DFS中位数:16个月)和更短的总生存期(OS中位数:22个月)比LINC00222高表达组(DFS中位数:24个月;操作系统中位数:31个月;分别为p=0.0139和0.0189)。4、LINC00222 NSCLC患者显著的表达水平与肿瘤大小、TNM阶段,淋巴结转移。5、LINC00222 upregulation抑制非小细胞肺癌细胞增殖,但凋亡。6、LINC00222upregulation抑制非小细胞肺癌细胞迁移和入侵。7、高表达的LINC00222可降低GSK-3β磷酸化水平,意味着其增强了GSK-3β的活性。8、细胞转染pCDNA-LINC00222后,细胞核内β-catenin蛋白质水平的表达明显降低,在加入TWS119后,细胞核β-catenin蛋白表达水平出现回复。9、RIP结果提示通LINC00222可与GSK-3β蛋白直接结合。结论:我们的研究数据表明LINC00222在非小细胞肺癌组织中低表达,LINC00222可抑制NSCLC细胞增殖,转移和侵袭,但促进凋亡,与Wnt/β-catenin相关信号通路密切相关。为非小细胞肺癌治疗提出了一个新的研究方向。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R734.2
【部分图文】：

图 3.1 LINC00222 在非小细胞肺癌组织及细胞中表达及与预后的关系(A) Real-time PCR 检测 LINC00222 在 103 对 NSCLC 癌组织及癌旁正常肺组织中的表达，结果比对 GAPDH。(B) Real-time PCR 检测 LINC00222 在 A549、LTEP-a-2 细胞中表达。所有实验重复 3 次。(C) Kaplan-Meier 生存曲线分析无进展生存期(DFS)，LINC00222 表达和患者相关性。(D) Kaplan-Meie 生存曲线分析总生存期(OS)，LINC00222 表达和患者相关性。*P < 0.05, **P < 0.01.Figure 3.1 The expression of LINC00222 in NSCLC tussues and cells and the relationship with prognosis.(A) Relative LINC00222 expression in 103 paired NSCLC samples and adjacent normal lung tissues wasexamined by Real-time quantitative PCR and normalized to GAPDH expression. (B) Relative LINC00222expression in A549 and LTEP-a-2 cells by Real-time quantitative PCR. Data are presented as mean ±SD obtainedfrom three independent experiments. (C) Kaplan-Meier survival analysis on disease-free survival (DFS) of thecorrelation of LINC00222 expression and patient survival. (D) Kaplan-Meier survival analysis on overall survival(OS) of the correlation of LINC00222 expression and patient survival. *P < 0.05, **P < 0.01.3.2 LINC00222 的表达与临床病理的关系

中国医科大学博士学位论文3.3 LINC00222 抑制非小细胞肺癌增殖、促进细胞凋亡为了证实 LINC00222 对非小细胞肺癌细胞增殖及凋亡的影响，我们首先构建 LINC00222 表达载体 pCDNA-LINC00222，分别转染 A549 及 LTEP-a-2 细胞系 pCDNA-LINC00222 及 empty vector 载体。Real-time PCR 检测转染后细胞内LINC00222 表达情况，结果显示相较转染 empty vector 载体，细胞转染pCDNA-LINC00222 载体后 LINC00222 RNA 表达水平明显提高，证实了转染效率较高（图 A）。利用 CCK-8 试剂盒，分别检测细胞酶标仪分别测定细胞 1h，24h，48h，72h，96h 时在 450nm 处的吸光度。结果显示，在转染 pCDNA-LINC00222载体后，A549 及 LTEP-a-2 细胞的增殖能力明显受到抑制（图 B, C）。利用 Hoechst33342/PI 染色法检测细胞凋亡情况，结果显示，在转染 pCDNA-LINC00222 载体后，A549 及 LTEP-a-2 细胞凋亡明显增加（图 D, E）。

图 3.3 LINC00222 对 NSCLC 细胞转移、侵袭的影响(A, B) 利用划痕实验分析检测转染 pCDNA-LINC00222 后 A549、LTEP-a-2 细胞转移能力。(C, D) 利用带有基底膜基质 Transwell 方法检测转染 pCDNA-LINC00222 后 A549、LTEP-a-2 细胞侵袭能力。所有实验重复 3 次。*P < 0.05, **P < 0.01.Figure 3.3 Effects of LINC00222 on NSCLC cell migration and invasion in vitro.(A, B) Wound-healing assay were used to determine the cell migration for pCDNA-LINC00222transfected A549 and LTEP-a-2 cells. (C, D) Transwell assay with Matrigel were used to determine the cellinvasion for pCDNA-LINC00222-transfected A549 and LTEP-a-2 cells. Values represented from threeindependent experiments. *P < 0.05 and **P < 0.01.
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本文编号：2852525