CHES1通过调节ERα活性影响乳腺癌增殖的分子机制

发布时间：2020-10-26 02:56

　　 乳腺癌一直是威胁女性健康的一大因素。在我国,乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势,并且越来越趋于年轻化。因此,阐明乳腺癌发生和发展过程中的分子机制,鉴定出一系列有价值的临床标志物,将有助于乳腺癌的临床诊断和药物治疗。乳腺癌的诱发因素有很多,其中雌激素暴露被证实同乳腺癌细胞的恶性增殖和侵袭转移存在直接的联系。雌激素受体α(EstrogenReceptorα,ERα)是细胞内响应雌激素刺激并且介导信号转导的关键因子,同时ERα也是临床上重要的药物靶点。然而,参与并调节雌激素-ERα通路的分子和信号非常复杂,并且随细胞内环境的差异呈现动态变化过程。因此,阐明雌激素信号通路和ERα功能的调节网络,一直是国内外研究的热点。检查点抑制因子1(Checkpoint Suppressor 1,CHES1)最早在酿酒酵母中被发现参与DNA损伤应答和细胞周期阻滞,因其包含有保守的叉头盒(Forkheadbox,FOX)DNA结合结构域,也叫FOXN3。之后的研究发现,CHES1可以参与蛋白质合成、葡萄糖代谢和胚胎发育等过程,并且被证实可以作为转录抑制因子参与转录调节过程。越来越多的研究表明CHES1同多种类型癌症的发生、发展和预后存在密切的联系。数据库分析表明CHES1可能发挥肿瘤抑制作用,并且其在乳腺癌中处于低表达状态。因此,本研究从蛋白分子间相互作用入手,在分子水平探究CHES1同雌激素信号通路之间的相关性和调控机理,以及对乳腺癌细胞增殖和成瘤作用的影响。本研究的主要内容如下:(1)免疫共沉淀、免疫荧光以及GST-pulldown等实验结果证明在乳腺癌细胞中,CHES1同ERα存在直接的相互作用,并且进一步鉴定出两者相互作用所依赖的结构域。(2)荧光素酶报告基因检测和反转录PCR等结果显示,CHES1可以作为ERα的转录辅抑制因子抑制ERα雌激素依赖的转录活性,并且可以抑制ERα下游靶基因CCND1、c-Myc以及pS2的mRNA和蛋白表达。(3)进一步的实验探究了CHES1抑制ERα转录活性的分子机制。蛋白免疫印迹以及免疫共沉淀等实验发现CHES1并不影响ERα的蛋白稳定性、二聚化以及亚细胞定位,并且不会影响ERα同组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)HDAC1和HDAC2的相互作用;深入研究发现CHES1可以通过招募去乙酰化酶SIRT1促进ERα的去乙酰化过程,进而抑制ERα在下游靶基因启动子上的富集和转录激活。(4)蛋白免疫印迹和免疫组化结果证实CHES1在ERα阳性的乳腺癌细胞中处于低表达状态,在ERα阴性的乳腺癌中处于高表达状态。进一步探究发现,在CHES1启动子区域存在一个保守的雌激素结合元件(Estrogenresponseelement,ERE),染色质免疫共沉淀和实时定量PCR数据显示,ERα可以响应雌激素的刺激识别ERE基序并结合到CHES1启动子上抑制其转录表达。利用数据库分析对上述结果进行了进一步验证,发现在乳腺癌中CHES1同ERα表达水平呈负相关。(5)通过细胞增殖和流式细胞实验证实CHES1在体外特异性抑制ERα阳性乳腺癌细胞的增殖和细胞周期进程,通过构建小鼠模型证实CHES1在体内显著抑制ERα阳性的乳腺癌细胞的成瘤能力。生物信息学分析表明CHES1的表达同乳腺癌病人的生存率紧密相关。综上所述,本研究揭示了在乳腺癌细胞中CHES1同雌激素信号通路之间存在相互调节的作用,这种作用共同参与ERα介导的转录激活和乳腺癌细胞增殖和成瘤过程。此外,本研究也探究了 CHES1在乳腺癌细胞中发挥的生物学功能,为乳腺癌的临床诊断和药物设计奠定了基础。
【学位单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【部分图文】：

作用于其他器官，在维持骨密度、防止骨质疏松，降低胆固醇水平、保护心血管系统以??及中枢神经系统的发育、认知行为的调节等方面均发挥不可或缺的作用。在女性体内，??存在四种天然的雌激素（图１．２），分别是雌素酮（Ｅｓｔｒｏｎ，Ｅｉ）、雌二醇（Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，Ｅ２）、??雌三醇（Ｅｓｔｒｉｏｌ，?Ｅ３）和雌四醇（Ｅｓｔｅｔｒｏｌ，?Ｅ４）?［４］。??Ｅ，?Ｅｓｔｒｏｎｅ?Ｅ２?Ｅｓｔｒａｄｉｏｌ??Ｅｊ?Ｅｓｔｒｉｏｌ?Ｅ４?Ｅｓｔｅｔｒｏｌ??图１．２四种雌激素的化学结构??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｔｈｅ?ｃｈｅｍｉｃａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?ｆｏｕｒ?ｅｓｔｒｏｇｅｎ??四种类型的雌激素分别存在于不同的生理时期，其中ｅ２是最广泛的存在形式，在??女性整个生育期间一直存在于血清并且可以有效激活雌激素信号通路。因此，ｅ２是雌激??素发挥功能的主要形式，也是后期临床药物设计的重要靶点。??自然界中，少数的昆虫和几乎所有的脊椎动物均可以分泌雌激素，在哺乳动物体内??雌激素由生殖器官如卵巢或胎盘合成并分泌到血液中，雄激素如睾酮和雄烯二酮也可以??通过芳香化酶（ａｒｏｍａｔａｓｅ）转化为雌激素［３１］。雌激素分泌之后

ｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｅｓｔｒｏｇｅｎ?ｓｉｇｎａｌ?ｐａｔｈｗ素信号通路还可以通过雌激素非依赖的方式激活，细胞膜上的?ｆａｃｔｏｒ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，?ＧＦＲｓ）如表皮生长因子受体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ?ｇｒｏ）和类胰岛素生长因子受体（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ?ｇｒｏｗｔｈ?ｆａｃｔｏｒ?ｒｅｃｅｐｔｏｒ，?Ｉ刺激后，可以直接活化ＥＲＫ和ＡＫＴ色氨酸／酪氨酸激酶，这些激饰，活化ＥＲａ激活下游靶基因的转录［３３，３４］。雌激素信号通路的经典的下游靶基因包括细胞周期调节子（如ＣＣＡ？八；？２八ｃ－Ｍ５ＣＬ２、５ＣＬＺＬ）、细胞黏附分子（ＳＭ４／八见ｔ／Ｇ）、炎症反应生成分子（如嗯ＧＦ）等［３５］。??调节因子??雌激素刺激之后，发生二聚化作用进而转运入核识别下游靶基因序列，ＥＲａ的ＤＢＤ结构域中包含有两个锌指结构域，靠近Ｎ识别ＥＲＥ基序（ＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣ，?ｎ代表任意碱基）（图１．４稳定ＥＲａ同非特异性ＤＮＡ分子之间的相互作用。ＥＲａ占据启

（１）?ＥＲａ转录辅激活因子：??ＥＲａ互作的转录辅激活因子有很多种类，包括最经典的ｐｌ６０家族、先锋因子??ｅｅｒ?ｆａｃｔｏｒｓ）、ＡＴＰ依赖的辅激活因子以及具有特定酶活性的辅因子（图１．５）。??家族是核受体最经典的转录辅激活因子，包含有三个成员：ＳＲＣ１、ＧＲＩＰ１［３６＃Ｄ??７，３８］。该家族成员均包含有同ＥＲａ互作所必需的ＬｘｘＬＬ氨基酸基序（ｘ代表任意??），当雌激素同ＥＲａ相结合时，ＥＲａＡＦ２结构域同ｐｌ６０家族蛋白的ＬｘｘＬＬ基序??，使ＥＲａ蛋白结构变成更加开放的构象，促进了?ＥＲａ同其他辅激活因子和ＤＮＡ??，进而加速转录起始［３９］。ＣｈＩＰ实验结果己经证实，在体内ＥＲａ和ｐｌ６０辅激活因??游靶基因ＣＴ５Ｄ?（ｃａ決Ｄ）和户幻启动子上呈现周期性动态结合和解聚，使??结构持续保持开放状态，促进了靶基因的持续转录激活（图１．６）。??ＡＦ－１?ＡＦ－２??Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ??３５８?３６２??１１８?１６７?３５１＾?［３７６?５４０??｜?！?｜?￣?＂１?￣?Ｉ??一?Ａ／Ｂ?■?Ｃ?４?Ｄ?｝?Ｅ?■?Ｆ?卜??
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本文编号：2856382