基于核酸适配体或纸喷雾离子化质谱技术建立结直肠癌外泌体快速检测方法

发布时间：2020-11-04 04:44

　　 结直肠癌是消化道常见肿瘤,近年来发病率有上升趋势。虽然粪隐血实验、结肠镜检等检查提高了结直肠癌的诊断率,但是,非侵入性的液体活检技术仍是早期发现结直肠癌、降低结直肠癌相关死亡率的预期诊断策略。目前大多数筛查方法都不足以取代传统的结直肠癌诊断方法(直肠指诊、影像学检查、结肠镜检查、病理检查),且癌胚抗原(CEA)作为疾病诊断标志物,对早期肿瘤的诊断价值不大。随着技术的进步及对癌症相关分子的深入研究,外泌体被认为是一种潜在的新型生物标志物。外泌体是一种直径30-200 nm的微囊泡,细胞通过内质网传递、胞吐等过程将外泌体释放到外周血、尿液、唾液、组织液等体液中。外泌体因其囊泡样结构携带大量生物分子,其中包括能够反映和代表宿主细胞来源的核酸和蛋白质。而且,癌细胞释放出的外泌体具有特异性的遗传信息和表观遗传修饰,使其在信号传递、肿瘤转移等方面发挥重要作用。结直肠癌肿瘤细胞在分泌外泌体的过程中,在外泌体表面、囊泡内都组装了结直肠癌细胞特异性的分子,如A33(vaccinia virus antigen)、上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、CEA等。从临床检测角度分析,携带有肿瘤特异性分子的外泌体,因其广泛分布于各种体液中,因此可以作为液体活检的新型检测标志物,应用于非侵入性的临床诊断操作。但是外泌体为纳米级结构,且肿瘤早期其在外周血中的数量相对较少,现有的常规临床检测方法很难对外泌体进行分离、富集和精确的定量检测,因此,建立快速、灵敏的外泌体检测方法是目前的研究需要。(一)新型纳米材料在微量检测中的应用越来越广,其中氧化石墨烯因其良好的生物相容性、比表面积大等特性,已被大量用于生物分子、活细胞检测。适配体是寡核苷酸单链,能够特异性地与检测目标(包括小分子化合物、蛋白、活细胞及外泌体等)结合,具有亲和力高、特异性强、可对其进行多种化学修饰等优点,氧化石墨烯能够与适配体通过分子间相互作用力结合,从而引起相关化学特性的改变。目前已有多项研究利用GO及适配体进行小分子化合物及活细胞的检测。但是,氧化石墨烯与荧光DNA单链适配体相互作用的方法在外泌体检测中还未有报道。本文在第一部分建立了一个基于氧化石墨烯与荧光DNA单链适配体相互作用的结直肠癌外泌体快速荧光检测方法,以结直肠癌外泌体特异性蛋白CD63和EpCAM为联合检测靶点,该体系利用荧光DNA单链适配体-GO复合体为探针,在与结直肠癌外泌体相互作用的过程中,复合体发生构象变化,GO对荧光DNA单链适配体的吸附和解离导致荧光猝灭和荧光恢复,通过荧光强度变化可对结直肠癌外泌体进行定量检测。实验过程中我们对反应条件及体系进行了优化,并以脱氧核糖核酸酶为工具酶,对荧光信号进行放大,最终得到对结直肠癌外泌体检测灵敏度达到2.1×10~4 particles/ml的检测方法,该检测可在30分钟内完成。用19例临床血清样本(5ml)对该方法进行验证,其可有效区分健康对照和结直肠癌患者(P0.05),证明该方法在临床实验室检测中具有潜在的应用价值。但是,该检测体系选择的检测靶点为EpCAM,EpCAM在胰腺癌、乳腺癌等肿瘤外泌体中也过量表达,因此该方法的特异性有待进一步提高。在下一步研究中,本课题将针对检测的特异性及灵敏度进行改进。(二)质谱检测具有灵敏度高、检测动态范围广、特异性强等特性,目前已被广泛应用于疾病诊断、微生物检测、药物分析等领域。为简化质谱检测方法,一些新型的常压电离方法已被开发出来,如纸喷雾电离技术。纸喷雾电离质谱检测具有高效、简便、无需对样品进行前处理等优点,但是在对生物样本进行检测时,因无样本前处理步骤,而生物样本内容物复杂,其他离子或蛋白质等分子会抑制待测物的信号,导致灵敏度较差。生物大分子因其分子量大,直接进行质谱分析时所得数据量大,不易分析。若在生物大分子上标记反应可逆的小分子化合物,通过检测小分子化合物间接对生物大分子进行定量分析,可极大提高检测效果。为进一步提高结直肠癌外泌体的检测灵敏度,本文在第二部分建立了一种基于免疫反应的接触式纸喷雾离子化质谱检测方法,用于检测样品中的结直肠癌外泌体。该方法构建了一个双层纸芯片用于样品前处理,用免疫方法对外泌体进行捕获,捕获抗体为抗CD63抗体,从而实现外泌体的纯化与富集;并且构建了两种可裂解的小分子离子探针(DMG-probe,DPA-probe),用离子探针对外泌体特异性检测抗体抗A33抗体进行标记,离子探针被裂解后进入质谱仪完成检测。本实验利用纸芯片实现了免疫反应与纸喷雾检测小分子离子探针的集成分析,DMG-probe和DPA-probe对结直肠癌外泌体的最低检测浓度分别为1.7×10~2 particles/ml和2.5×10~2 particles/ml,其灵敏度是第一部分氧化石墨烯方法的100倍。而且,该纸芯片可对捕获的外泌体样本进行长期有效保存(30天),因此可用于患者自助式分析,即患者在家中或其他场所完成纸芯片上的免疫反应,然后将纸芯片送至质谱检测机构进行检测。本文分别利用新型纳米材料和纸喷雾离子化质谱方法建立了两种结直肠癌外泌体快速检测平台,两种方法均具有快速、方便、高灵敏度的特点,在肿瘤外泌体的临床诊断中具有很大的应用前景。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.34;R730.43
【部分图文】：

对结直肠癌外泌体进行双靶点联合检测，所选检测目标为 CD63 和 EpCAM，CD63 是一种膜蛋白，是外泌体标志性蛋白；EpCAM 是一种跨膜糖蛋白，在上皮细胞中介导 Ca2+非依赖性同型细胞黏附，多个结直肠癌外泌体蛋白质组学研究证实EpCAM 是结直肠肿瘤组织来源外泌体的特异性蛋白。且 CD63 及 EpCAM 蛋白对应的高特异性高亲和力的适配体均已被筛选出来[28][29][30]。在该检测系统中，分别用不同的荧光染料对 CD63 适配体及 EpCAM 适配体进行修饰，并用适当浓度的 GO 水溶液使适配体荧光淬灭。加入结直肠癌外泌体后，CD63 适配体及 EpCAM 适配体从GO 上解离并与外泌体表面上的目的蛋白结合，从而使两种荧光同时恢复。在此过程中，DNase I 可剪切与外泌体蛋白结合的单链 DNA 适配体，将外泌体释放到体系中继续与 GO 上的适配体结合，从而达到荧光信号增强的效果。GO 对其结合的核酸适配体具有保护作用，DNase I 不能水解 GO 上的适配体，只能水解与外泌体蛋白结合的适配体，从而保证了检测的有效性。具体检测流程见图 1。该部分课题首先以结直肠癌细胞系（SW480）外泌体为检测目标，以验证可方法的可行性，并对 GO 浓度、适配体荧光淬灭时间、DNase I 酶反应时间等条件进行优化，以获得经济、快速、灵敏的检测体系。体系优化后，对结直肠癌患者血清进行检测，以验证其临床检测能力。

系统检测各血清样品，并与临床 CEA 结果进行对照，比较该系统的检测阳性率。3.2.11 统计学分析：采用 SPSS 22.0 for windows 和 Origin 8.0 进行统计学分析，三组以上组间比较用LSD-t 检验，数据满足正态分布（Shapiro-Wilk 检验 P>0.1）及方差齐性（P>0.05）；结肠癌患者与健康对照间比较用两个独立样本非参数 Mann-Whitney 检验。LSD-t 检验与 M-W 检验水准均为 α=0.05，Shapiro-Wilk 检验水准为 α=0.1。四、结果4.1 外泌体特征及定量检测。用场发射透射电镜对结直肠癌细胞系外泌体进行形态学分析，镜下观察到典型的外泌体膜结构（图 2-A），直径~50 nm，大小与文献中报道的外泌体大小相似；用 NTA对细胞系外泌体大小进行跟踪后显示，外泌体浓度为 3×1010particles/ml，其粒径主要分布在 105nm 左右（图 2-B）。用 BCA 法对外泌体总蛋白浓度进行定量检测，测定结果总蛋白量为 1600 g/ml。

医大学博士学位论文4.2 氧化石墨烯最优淬灭浓度为 0.1 mg/ml。将 GO 浓度设定为 0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/ml，与荧光D63-Aptamer-Cy3 和 EpCAM-Aptamer-FAM 共孵育后测定两种荧光染料的荧从图 3 中可看出，当 GO 浓度达到 0.1 mg/ml 时，FAM 荧光已被完全淬灭与 FAM 结果相同。为保证适配体荧光有效淬灭及恢复，将体系中的 GO 浓 0.1 mg/ml。
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本文编号：2869632