HMGB1结合RAGE通过调控自噬影响肾癌发展的实验研究

发布时间：2020-11-20 01:08

　　 第一部分临床水平研究HMGB1/RAGE与自噬在肾癌组织中的表达【目的】通过检测肾透明细胞癌的临床样本,分析HMGB1/RAGE和自噬相关标记物(LC3、Beclin-1、PIK3),明确肾癌组织中HMGB1/RAGE的表达和自噬是否具有相关性,临床水平研究肾癌中HMGB1/RAGE和自噬的表达情况。【方法】Western-Blot、qRT-PCR和免疫荧光法检测12例肾透明细胞癌和相应癌旁组织的HMGB1/RAGE和自噬相关标记物(LC3、Beclin-1、PIK3)的表达情况。【结果】1.Western-Blot见肾透明细胞癌中HMGB1蛋白表达水平(0.6138±0.0691)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.2247±0.0512)(P0.001);RAGE蛋白表达水平(0.5467±0.0368)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.2803±0.0415)(P0.001);LC3蛋白表达水平(0.4994±0.0674)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.1293±0.0213)(P0.001);Belcin-1蛋白表达水平(0.5370±0.0608)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.1556±0.0359)(P0.001);PIK3蛋白表达水平(0.4189±0.0570)较癌旁肾组织表达水平(0.2427±0.0463)有升高趋势(P=0.025)。2.qRT-PCR见肾透明细胞癌中HMGB1 m RNA表达水平(1.1978±0.2311)较癌旁肾组织表达水平(0.8093±0.2531)有增高趋势,但无统计学差异(P=0.098);RAGE m RNA表达水平(1.7319±0.2784)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.8759±0.2043)(P=0.002);LC3 m RNA表达水平(1.5504±0.1878)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.7423±0.1126)(P=0.004);Belcin-1 m RNA表达水平(1.4572±0.1757)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.6501±0.0530)(P=0.001);PIK3 m RNA表达水平(1.2629±0.1539)明显高于癌旁肾组织表达水平(0.7201±0.0804)(P=0.001)。3.免疫荧光见肾透明细胞癌中HMGB1/RAGE和自噬蛋白LC3、Beclin-1、PIK3的表达较癌旁正常组织明显增强。【结论】肾透明细胞癌组织中HMGB1/RAGE和自噬(LC3,Beclin-1,PIK3)均较癌旁组织明显升高。HMGB1/RAGE和自噬可能在肾肿瘤中发挥重要作用,对肾癌的发生发展具有临床意义。第二部分细胞水平研究HMGB1/RAGE对肾癌细胞自噬、凋亡、迁移、增殖和血管生成的影响【目的】通过检测肾透明细胞癌的临床样本,Western-Blot和qRT-PCR方法检测12例肾透明细胞癌和相应癌旁组织的HMGB1/RAGE和自噬相关标记物(LC3、Beclin-1、PIK3)的表达情况,发现肾癌组织中HMGB1、RAGE和LC3、Beclin-1、PIK3较癌旁组织中均有明显升高,初步印证HMGB1/RAGE和自噬可能对肾癌的发生发展具有临床意义。本部分研究旨在通过体外实验,高表达HMGB1,si RNA沉默HMGB1,可溶性RAGE(s RAGE)阻断HMGB1和RAGE的结合,细胞水平证实HMGB1通过结合RAGE,诱导细胞自噬,降低凋亡水平,促进肾癌细胞血管生成、增殖以及迁移。【方法】选用人肾癌细胞株A489、ACHN作为研究对象,分别利用质粒转染技术高表达HMGB1,si RNA干扰技术沉默HMGB1,s RAGE阻断HMGB1和RAGE的结合,缺氧环境下培养72h后,采用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光检测自噬相关标记物(LC3、Beclin-1)、HMGB1和RAGE,流式细胞术和CCK-8检测细胞凋亡、增殖变化,Transwell小室检测各组细胞的迁移情况。肾癌细胞与血管内皮细胞共培养,分别高表达HMGB1、沉默HMGB1,s RAGE阻断HMGB1和RAGE的结合,采用qRT-PCR和Western blot检测VEGF和VEGFR-2反应血管生成的基因和蛋白表达变化。【结果】1.对HMGB1表达进行抑制,可使肾癌细胞的活性和迁移能力减弱,加快肿瘤细胞的凋亡速度。通过CCK8和流式细胞术检测各组细胞的生长和凋亡情况,发现HMGB1的干扰、过表达和s RAGE对A498和ACHN细胞的生长和凋亡有影响。HMGB1-si RNA转染组和s RAGE处理组肾癌细胞的生长被抑制,细胞凋亡明显增加。Transwell检测各组A49和ACHN细胞的迁移能力发现,与si RNA转染对照组相比,HMGB1-si RNA转染组和s RAGE处理组细胞迁移能力降低,HMGB1过表达载体组细胞细胞迁移能力上调。2.HMGB1的干扰、过表达和s RAGE影响A498和ACHN细胞中LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表达。采用Western blot和qRT-PCR检测A498和ACHN各组细胞中LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1的m RNA表达水平,发现与si RNA转染对照组相比,HMGB1-si RNA转染组LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表达量显著降低;与空载载体对照组相比,HMGB1过表达载体组LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表达量显著上调;与s RAGE处理组相比,HMGB1-Vec+s RAGE组LC3、Beclin1、RAGE和HMGB1蛋白的表达量显著上调。3.HMGB1的干扰和s RAGE的处理抑制A498和ACHN细胞共培养后HUVEC细胞中VEGF和VEGFR2 m RNA的表达,HMGB1的过表达促进A498和ACHN细胞共培养后HUVEC细胞中VEGF和VEGFR2 m RNA的表达。提示HMGB1的抑制可下调VEGF和VEGFR2表达,为肾癌介入治疗的目标提供了未来方向。【结论】质粒转染高表达HMGB1、si RNA干扰沉默HMGB以及s RAGE阻断HMGB1和RAGE的结合,可影响肾癌细胞存活率、凋亡、侵袭、自噬和血管生成能力。HMGB1结合RAGE可诱导细胞自噬,降低细胞凋亡,促进血管生成,增强肾癌细胞的增殖、迁移能力。HMGB1可能是一个潜在的肾癌诊断和治疗的靶点。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.11
【部分图文】：

第一部分临床水平研究HMGB1/RAGE与细胞自噬在肾癌组织中表达及两者相关性研究背景我们前期分析了 RCC 患者的肿瘤标本，发现 RAGE 在肿瘤组织中明显高达，尤其在肿瘤血管周围明显增多，并与肿瘤的大小、分期具有一定相关性远处转移患者的 RAGE mRNA 明显高于无转移者。随访研究中发现 RAGE 的达同患者的 5 年生存率呈负相关。RAGE 与 RCC 具有的临床相关性提示我们RAGE 可能在肾透明细胞癌的发生、发展中具有重要作用，但是其作用机制尚明了。

图2：RAGE在RCC中的表达与患者生存期和远处转移相关。A：远处转移患者的RAGE mRNA明显高于无转移者；B：RAGE的表达与生存率呈负相关；C:RAGE的表达与无肿瘤转移生存率呈负相关前期实验中另外发现，RAGE在RCC中的表达与肿瘤微血管密度MVD、VEGF-2正相关。我们从基因和蛋白水平进行了检测，发现RAGE表达越高的肿瘤组织中VEGFR-2 mRNA的表达越多，具有明显正相关性，VEGFR-2蛋白的水平也有明显的升高趋势。

图2：RAGE在RCC中的表达与患者生存期和远处转移相关。A：远处转移患者的RAGE mRNA明显高于无转移者；B：RAGE的表达与生存率呈负相关；C:RAGE的表达与无肿瘤转移生存率呈负相关前期实验中另外发现，RAGE在RCC中的表达与肿瘤微血管密度MVD、VEGF-2正相关。我们从基因和蛋白水平进行了检测，发现RAGE表达越高的肿瘤组织中VEGFR-2 mRNA的表达越多，具有明显正相关性，VEGFR-2蛋白的水平也有明显的升高趋势。
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本文编号：2890706