食管癌TET突变体的筛选与鉴定
发布时间：2021-01-03 00:17
TET蛋白是一种重要的羟甲基化酶,包括TET1、TET2和TET3,它可以催化5-甲基胞嘧啶（5-methyl-cytosine,5mC）形成5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethyl-cytosine,5hmC）。TET蛋白在肿瘤等疾病的发生和发展过程中起着重要的作用。目前,TET2和TET3被广泛的认为是一种抑癌基因,但对于TET1的作用存在争议。基因突变是肿瘤发生的重要原因,TET蛋白家族在肿瘤中已发现多个基因突变位点,尤其是TET2的突变频率较高,有关TET1突变的报道很少,目前为止TET3的突变报道也仅有一例。研究TET蛋白家族在肿瘤中的突变对分析TET影响该肿瘤发生的机制有重要意义。对临床样本25例食管癌组织和25例癌旁组织进行DNA提取,之后进行TET突变位点的筛选,对于筛选出的突变位点在食管癌细胞系中验证。对临床样本25例食管癌组织和25例癌旁组织进行RNA提取,利用荧光定量PCR技术检测TET在食管癌中的表达情况,进一步结合TCGA数据库对TET1与食管癌的相关性进行临床数据分析。利用位点特异性变异技术对TET1质粒进行定点突变,将野生型和突变型的TET1质粒转...
【文章来源】：北京工业大学北京市 211工程院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第1章 绪论
1.1 表观遗传学
1.2 TET蛋白
1.3 TET与肿瘤的关系
1.4 TET基因突变
1.5 食管癌的研究现状
1.6 课题研究的目的及意义
第2章 TET1、2、3突变体的筛选
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 仪器设备
2.2.2 试剂及耗材
2.3 实验方法
2.3.1 组织内提取DNA
2.3.2 细胞内提取DNA
2.3.3 细胞内提取RNA
2.3.4 Q5高保真酶PCR
2.3.5 切胶回收目的基因产物
2.4 实验结果
2.4.1 食管癌和癌旁组织DNA的提取和TET1、2、3编码区扩增引物的设计
2.4.2 TET1、2、3编码区的扩增与测序
2.4.3 食管癌细胞中突变位点的筛选
2.4.4 TET基因在食管癌中的突变率分析
2.4.5 TET突变位点位置分析
2.5 本章小结
第3章 TET1、2、3在食管癌中的表达检测
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 仪器设备
3.2.2 试剂及耗材
3.3 实验方法
3.3.1 组织内提取RNA
3.3.2 RT-PCR
3.4 实验结果
3.4.1 组织RNA的提取和TET1、2、3RT-PCR扩增引物的设计
3.4.2 分析TET1、2、3在食管癌及癌旁组织中的表达
3.4.3 分析TET1、2、3在食管癌细胞及正常食管细胞中的表达
3.4.4 TET1在食管癌中的临床数据分析
3.5 本章小结
第4章 TET1突变位点鉴定
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 仪器设备
4.2.2 试剂及耗材
4.3 实验方法
4.3.1 突变体质粒构建
4.3.2 LB培养基的配制
4.3.3 大肠杆菌热击转化
4.3.4 无内毒素质粒大提
4.3.5 细胞复苏
4.3.6 细胞传代
4.3.7 Chemifect细胞转染
4.3.8 细胞内提取蛋白
4.3.9 蛋白定量（BCA法定量）
4.3.10 SDS-PAGE凝胶电泳
4.3.11 DNA dotblot
4.3.12 MTT细胞增殖实验
4.3.13 细胞划痕实验
4.3.14 Transwell
4.4 实验结果
4.4.1 突变型TET1质粒的构建
4.4.2 TET1突变体羟甲基化和蛋白表达功能的鉴定
4.4.3 TET1突变体对EC109细胞功能的影响
4.4.4 TET1突变体影响EC109细胞功能的可能性机制探讨
4.5 本章小结
结论
参考文献
攻读硕士学位期间所发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Metalloproteinases as mediators of inflammation and the eyes:molecular genetic underpinnings governing ocular pathophysiology[J]. Mahavir Singh,Suresh C Tyagi. International Journal of Ophthalmology. 2017(08)
[2]TET1基因敲除的宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭能力观察[J]. 沈凤,丁妍,谭玉洁. 山东医药. 2017(22)
[3]VEGF、JAK2/STAT3信号通路与妇科疾病的关系[J]. 殷震惠,杨华. 国际妇产科学杂志. 2016(06)
[4]ALC1介导的MAPK信号通路激活对肝癌细胞增殖的影响[J]. 李杨,冯丽,陈娟,成炜,刘珊珊,刘玉荣,马宁芳. 解剖学研究. 2016(01)
[5]乳腺癌组织中TET2突变与5hmC表达的关系[J]. 顾盼盼,罗欣,张宏伟,谭理,陈浩,孔令春,刁建波,石雨江,马端. 中国临床医学. 2015(01)
[6]原发性骨髓纤维化63例转化为白血病的危险因素分析[J]. 刘洋,周凡,刘景华,刘彦琴,王吉刚,白颖,郭步云,吴丹彤. 临床军医杂志. 2014(07)
[7]TET家族DNA羟化酶与5-hmC在肿瘤中的作用机制的研究进展[J]. 吴怡晨,凌志强. 中国细胞生物学学报. 2013(12)
[8]食管癌相关基因突变的研究进展[J]. 姜孝芳,李恵武. 新疆医科大学学报. 2010(07)
[9]食管癌发生发展过程中的相关癌基因[J]. 乔颖,左静,刘巍. 临床荟萃. 2009(04)
[10]TNF-α基因启动子单核苷酸多态性的功能意义[J]. 张佃良,于宝军. 世界华人消化杂志. 2004(10)
博士论文
[1]TET1在肾癌中表达及其抑制肿瘤的作用机制研究[D]. 范敏.苏州大学 2015
[2]骨髓增生异常综合征TET2突变及5-hmC水平分析和预后评估研究[D]. 刘小柳.中南大学 2013
硕士论文
[1]TET1通过诱导抑癌基因Rassf5上调从而抑制卵巢癌细胞增殖的研究[D]. 李伯泰.浙江大学 2017
[2]TETs表达与结直肠癌发生发展的关系及TET1表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响[D]. 田宜平.浙江大学 2016
本文编号：2953929
【文章来源】：北京工业大学北京市 211工程院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
缩略词表
第1章 绪论
1.1 表观遗传学
1.2 TET蛋白
1.3 TET与肿瘤的关系
1.4 TET基因突变
1.5 食管癌的研究现状
1.6 课题研究的目的及意义
第2章 TET1、2、3突变体的筛选
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 仪器设备
2.2.2 试剂及耗材
2.3 实验方法
2.3.1 组织内提取DNA
2.3.2 细胞内提取DNA
2.3.3 细胞内提取RNA
2.3.4 Q5高保真酶PCR
2.3.5 切胶回收目的基因产物
2.4 实验结果
2.4.1 食管癌和癌旁组织DNA的提取和TET1、2、3编码区扩增引物的设计
2.4.2 TET1、2、3编码区的扩增与测序
2.4.3 食管癌细胞中突变位点的筛选
2.4.4 TET基因在食管癌中的突变率分析
2.4.5 TET突变位点位置分析
2.5 本章小结
第3章 TET1、2、3在食管癌中的表达检测
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 仪器设备
3.2.2 试剂及耗材
3.3 实验方法
3.3.1 组织内提取RNA
3.3.2 RT-PCR
3.4 实验结果
3.4.1 组织RNA的提取和TET1、2、3RT-PCR扩增引物的设计
3.4.2 分析TET1、2、3在食管癌及癌旁组织中的表达
3.4.3 分析TET1、2、3在食管癌细胞及正常食管细胞中的表达
3.4.4 TET1在食管癌中的临床数据分析
3.5 本章小结
第4章 TET1突变位点鉴定
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 仪器设备
4.2.2 试剂及耗材
4.3 实验方法
4.3.1 突变体质粒构建
4.3.2 LB培养基的配制
4.3.3 大肠杆菌热击转化
4.3.4 无内毒素质粒大提
4.3.5 细胞复苏
4.3.6 细胞传代
4.3.7 Chemifect细胞转染
4.3.8 细胞内提取蛋白
4.3.9 蛋白定量（BCA法定量）
4.3.10 SDS-PAGE凝胶电泳
4.3.11 DNA dotblot
4.3.12 MTT细胞增殖实验
4.3.13 细胞划痕实验
4.3.14 Transwell
4.4 实验结果
4.4.1 突变型TET1质粒的构建
4.4.2 TET1突变体羟甲基化和蛋白表达功能的鉴定
4.4.3 TET1突变体对EC109细胞功能的影响
4.4.4 TET1突变体影响EC109细胞功能的可能性机制探讨
4.5 本章小结
结论
参考文献
攻读硕士学位期间所发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Metalloproteinases as mediators of inflammation and the eyes:molecular genetic underpinnings governing ocular pathophysiology[J]. Mahavir Singh,Suresh C Tyagi. International Journal of Ophthalmology. 2017(08)
[2]TET1基因敲除的宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭能力观察[J]. 沈凤,丁妍,谭玉洁. 山东医药. 2017(22)
[3]VEGF、JAK2/STAT3信号通路与妇科疾病的关系[J]. 殷震惠,杨华. 国际妇产科学杂志. 2016(06)
[4]ALC1介导的MAPK信号通路激活对肝癌细胞增殖的影响[J]. 李杨,冯丽,陈娟,成炜,刘珊珊,刘玉荣,马宁芳. 解剖学研究. 2016(01)
[5]乳腺癌组织中TET2突变与5hmC表达的关系[J]. 顾盼盼,罗欣,张宏伟,谭理,陈浩,孔令春,刁建波,石雨江,马端. 中国临床医学. 2015(01)
[6]原发性骨髓纤维化63例转化为白血病的危险因素分析[J]. 刘洋,周凡,刘景华,刘彦琴,王吉刚,白颖,郭步云,吴丹彤. 临床军医杂志. 2014(07)
[7]TET家族DNA羟化酶与5-hmC在肿瘤中的作用机制的研究进展[J]. 吴怡晨,凌志强. 中国细胞生物学学报. 2013(12)
[8]食管癌相关基因突变的研究进展[J]. 姜孝芳,李恵武. 新疆医科大学学报. 2010(07)
[9]食管癌发生发展过程中的相关癌基因[J]. 乔颖,左静,刘巍. 临床荟萃. 2009(04)
[10]TNF-α基因启动子单核苷酸多态性的功能意义[J]. 张佃良,于宝军. 世界华人消化杂志. 2004(10)
博士论文
[1]TET1在肾癌中表达及其抑制肿瘤的作用机制研究[D]. 范敏.苏州大学 2015
[2]骨髓增生异常综合征TET2突变及5-hmC水平分析和预后评估研究[D]. 刘小柳.中南大学 2013
硕士论文
[1]TET1通过诱导抑癌基因Rassf5上调从而抑制卵巢癌细胞增殖的研究[D]. 李伯泰.浙江大学 2017
[2]TETs表达与结直肠癌发生发展的关系及TET1表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响[D]. 田宜平.浙江大学 2016
本文编号：2953929
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