运用SELEX技术在体外进行膀胱癌T24细胞适配子筛选方法的建立

发布时间：2021-01-14 20:32

　　目的:运用SELEX技术筛选膀胱癌T24细胞适配子,为后续膀胱癌早期诊断方法的建立奠定基础。方法:在体外人工合成两端各有18bp的固定序列,中间含有52bp的随机序列的单链寡核苷酸文库,通过对PCR反应条件的不断优化与改良,运用SELEX技术对膀胱癌细胞适配子进行反复多轮次的筛选,并用流式细胞技术对得到的不同筛选轮次的适配子亲和力进行测定,将最后一轮筛选得到的产物进行克隆,后交由测序公司进行测序,并用软件对得到的适配子序列的一级结构和二级结构进行分析。结果:1、PCR反应目的产物的量及纯度很大程度上受不同的退火温度及循环次数的影响,本实验中对称PCR反应的最佳退火温度为62℃,最佳循环次数为25次;2、经过10轮SELEX筛选,获得的ss DNA文库与膀胱癌T24细胞的亲和力逐渐上升,表明不同轮次筛选后获得的目的适配子逐步得到了富集。结论:成功建立了运用SELEX技术体外筛选膀胱癌T24细胞高亲和力和特异性的适配子的方法,并得到了亲和力较高的适配子。 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：49 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
综述
第1章 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 随机寡核苷酸文库及上下游引物
        1.1.2 细胞株及菌株
        1.1.3 试剂及工具酶
        1.1.4 主要仪器
        1.1.5 常用试剂配制
    1.2 方法
        1.2.1 膀胱癌T24的复苏、换液、传代及冻存
        1.2.2 PCR扩增条件的优化
        1.2.3 膀胱癌T24单细胞悬液的制备
        1.2.4 直接不对称PCR法及超滤离心法制备初级筛选文库
        1.2.5 次级文库的制备与筛选
        1.2.6 正常人尿路上皮细胞的反筛
        1.2.7 运用流式细胞技术检测不同筛选轮次ssDNA的亲和力
        1.2.8 目的片段的回收及纯化
        1.2.9 目的DNA的克隆与测序
        1.2.10 适配子二级结构分析
第2章 实验结果
    2.1 膀胱癌细胞的培养
    2.2 PCR反应条件的优化
        2.2.1 普通对称PCR反应条件优化结果
        2.2.2 不对称PCR反应条件优化结果
    2.3 运用流式细胞技术对不同筛选轮次ssDNA的亲和力检测结果
    2.4 目的 DNA 的纯化及回收结果
    2.5 重组质粒的转化结果
    2.6 重组质粒的酶切鉴定
    2.7 重组质粒的PCR反应鉴定
    2.8 目的DNA片段的测序
    2.9 适配子二级结构的预测
第3章 讨论
第4章 结论
参考文献
作者简介及在学期间所取得的科研成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]中国膀胱癌发病现状及流行趋势分析[J]. 韩苏军,张思维,陈万青,李长岭.  癌症进展. 2013(01)
[2]随机单链DNA文库SELEX筛选寡核苷酸适配子方法的建立[J]. 詹林盛,邵宁生,彭剑淳,孙红琰,王全立.  生物化学与生物物理进展. 2003(01)



本文编号：2977497