CA916798促进非小细胞肺癌EGFR-TKI获得性耐药的作用及其机制研究
发布时间：2021-01-27 03:06
肺癌是目前全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要组织学类型,占全部肺癌的85%左右。大多数肺癌患者被发现时已处于晚期,预后较差。近年来,以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI）吉非替尼（Gefitinib）为代表的分子靶向药物取代传统的细胞毒性药物,在晚期NSCLC EGFR敏感突变（主要包括19外显子缺失突变、21外显子L858R点突变）患者的治疗中获得巨大成功。然而,经过一段时间的治疗（中位时间8-12个月）大多数患者会对EGFR-TKI产生获得性耐药,因而限制了其临床应用和疗效,成为晚期NSCLC靶向治疗亟待解决的关键问题之一。许多研究证实EGFR-TKI耐药与EGFR二次突变、旁路激活、表型转换等有关。针对已发现的耐药机制,EGFR-TKI已在不断更新换代,而且临床上也在发展各种联合化疗方案,但效果仍不尽人意。因此,探寻新的耐药机制仍任重道远。...
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
EGFR-TKIs获得性耐药肺腺癌细胞株高表达CA916798（A)CCK-8法检测吉非替尼敏感株PC9和获得性耐药株PC9/GR对吉非替尼的IC50（上图）
第三章CA916798促进NSCLC细胞对EGFR-TKI耐药的作用25靶向CA916798的shRNA序列和1条无意序列（scramble，mock)的慢病毒分别感染NSCLC细胞，经过嘌呤霉素的筛选获得稳定敲低CA916798的细胞。经qRT-PCR验证发现相对于mock细胞，shRNA在PC9/GR细胞和HCC827/IR细胞中敲低CA96798的效率均大于70%（图3-2A），经Westernblot验证，该shRNA也能在蛋白水平上显著敲低CA916798的表达（图1-2B)，将经过该shRNA感染、筛选后的细胞命名为shCA916798（简写为shCA），并用于后续实验。用含CA916798全长序列质粒和空载体（control)质粒包装的慢病毒感染对药物敏感的NSCLC细胞，经过嘌呤霉素筛选获得稳定过表达CA916798细胞。qRT-PCR验证显示，相比于control细胞，PC9细胞和HCC827细胞中CA916798的mRNA均显著上调（图3-2C），Westernblot检测显示过表达细胞中CA916798蛋白的表达水平显著增加（图3-2D），此过表达细胞命名为OE-CA916798（简写为OE-CA），用于后续实验。这些实验结果表明，我们成功建立了稳定敲低CA916798的肺癌耐药细胞株及稳定过表达CA916798肺癌敏感细胞株。图3-2mRNA及蛋白水平检测在NSCLC细胞中敲低和过表达CA916798的效率（A)qRT-PCR从mRNA水平检测在EGFR-TKIs获得性耐药NSCLC细胞株中敲低CA916798的效率。（B)WesternBlot在蛋白水平检测在EGFR-TKIs获得性耐药NSCLC细胞株中敲低CA916798的效率。（C）qRT-PCR从mRNA水平检测在EGFR-TKIs敏感NSCLC细胞株中过表达CA916798的效率。（D）WesternBlot从蛋白水平实验检测在EGFR-TKIs敏感NSCLC细胞株中过表达CA916798的效率。3.3.3敲低CA916798可提高NSCLC耐药细胞株对EGFR-TKIs的敏感性为了验证CA916798对细胞耐药性的影响，我们采用CCK-8法检测敲低
西南大学硕士学位论文26CA916798后细胞对EGFR-TKIs药物的半抑制浓度（IC50）的变化。结果显示，在PC9/GR细胞中敲低CA196798后，PC9/GR对吉非替尼的IC50显著降低，由10.34μM降至3.92μM（p<0.01）（图3-3A）。同样在HCC827/IR细胞中敲低CA916798后，HCC827/IR对埃克替尼的IC50也显著降低，由13.34μM降至8.07μM（p<0.05)（图3-3B）。以上结果说明，敲低CA916798可显著降低耐药NSCLC细胞对EGFR-TKIs的IC50，提高NSCLC耐药细胞对EGFR-TKIs药物的敏感性。图3-3敲低CA916798提高NSCLC耐药株对EGFR-TKIs敏感性（A）CCK-8法检测在吉非替尼耐药株PC9/GR中敲低CA916798后细胞对吉非替尼IC50的变化，与对照细胞相比较，敲低CA916798后IC50显著降低（**，p<0.01)。（B）CCK-8法检测在埃克替尼耐药株HCC827/IR中敲低CA916798后细胞对埃克替尼IC50的变化，与对照细胞相比较，敲低CA916798导致IC50显著降低（*，p<0.05)。3.3.4过表达CA916798可降低NSCLC耐药细胞株对EGFR-TKIs的敏感性我们在EGFR-TKIs敏感细胞中过表达CA916798，并采用CCK-8法检测过表达CA916798对EGFR-TKIsIC50的影响，与对照细胞相比较，过表达CA916798引起PC9细胞对吉非替尼的IC50显著上升，由0.48μM提高至2.60μM（（p<0.001）（图3-4A）；而在另一株细胞HCC827细胞中过表达CA916798后，也使该细胞对埃克替尼的IC50显著提高，由0.06μM提高至1.42μM（p<0.001）（图3-4B）。以上结果说明过表达CA916798可显著提高敏感细胞对EGFR-TKIs的IC50，降低敏感细胞对EGFR-TKIs药物的敏感性。
本文编号：3002308
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
EGFR-TKIs获得性耐药肺腺癌细胞株高表达CA916798（A)CCK-8法检测吉非替尼敏感株PC9和获得性耐药株PC9/GR对吉非替尼的IC50（上图）
第三章CA916798促进NSCLC细胞对EGFR-TKI耐药的作用25靶向CA916798的shRNA序列和1条无意序列（scramble，mock)的慢病毒分别感染NSCLC细胞，经过嘌呤霉素的筛选获得稳定敲低CA916798的细胞。经qRT-PCR验证发现相对于mock细胞，shRNA在PC9/GR细胞和HCC827/IR细胞中敲低CA96798的效率均大于70%（图3-2A），经Westernblot验证，该shRNA也能在蛋白水平上显著敲低CA916798的表达（图1-2B)，将经过该shRNA感染、筛选后的细胞命名为shCA916798（简写为shCA），并用于后续实验。用含CA916798全长序列质粒和空载体（control)质粒包装的慢病毒感染对药物敏感的NSCLC细胞，经过嘌呤霉素筛选获得稳定过表达CA916798细胞。qRT-PCR验证显示，相比于control细胞，PC9细胞和HCC827细胞中CA916798的mRNA均显著上调（图3-2C），Westernblot检测显示过表达细胞中CA916798蛋白的表达水平显著增加（图3-2D），此过表达细胞命名为OE-CA916798（简写为OE-CA），用于后续实验。这些实验结果表明，我们成功建立了稳定敲低CA916798的肺癌耐药细胞株及稳定过表达CA916798肺癌敏感细胞株。图3-2mRNA及蛋白水平检测在NSCLC细胞中敲低和过表达CA916798的效率（A)qRT-PCR从mRNA水平检测在EGFR-TKIs获得性耐药NSCLC细胞株中敲低CA916798的效率。（B)WesternBlot在蛋白水平检测在EGFR-TKIs获得性耐药NSCLC细胞株中敲低CA916798的效率。（C）qRT-PCR从mRNA水平检测在EGFR-TKIs敏感NSCLC细胞株中过表达CA916798的效率。（D）WesternBlot从蛋白水平实验检测在EGFR-TKIs敏感NSCLC细胞株中过表达CA916798的效率。3.3.3敲低CA916798可提高NSCLC耐药细胞株对EGFR-TKIs的敏感性为了验证CA916798对细胞耐药性的影响，我们采用CCK-8法检测敲低
西南大学硕士学位论文26CA916798后细胞对EGFR-TKIs药物的半抑制浓度（IC50）的变化。结果显示，在PC9/GR细胞中敲低CA196798后，PC9/GR对吉非替尼的IC50显著降低，由10.34μM降至3.92μM（p<0.01）（图3-3A）。同样在HCC827/IR细胞中敲低CA916798后，HCC827/IR对埃克替尼的IC50也显著降低，由13.34μM降至8.07μM（p<0.05)（图3-3B）。以上结果说明，敲低CA916798可显著降低耐药NSCLC细胞对EGFR-TKIs的IC50，提高NSCLC耐药细胞对EGFR-TKIs药物的敏感性。图3-3敲低CA916798提高NSCLC耐药株对EGFR-TKIs敏感性（A）CCK-8法检测在吉非替尼耐药株PC9/GR中敲低CA916798后细胞对吉非替尼IC50的变化，与对照细胞相比较，敲低CA916798后IC50显著降低（**，p<0.01)。（B）CCK-8法检测在埃克替尼耐药株HCC827/IR中敲低CA916798后细胞对埃克替尼IC50的变化，与对照细胞相比较，敲低CA916798导致IC50显著降低（*，p<0.05)。3.3.4过表达CA916798可降低NSCLC耐药细胞株对EGFR-TKIs的敏感性我们在EGFR-TKIs敏感细胞中过表达CA916798，并采用CCK-8法检测过表达CA916798对EGFR-TKIsIC50的影响，与对照细胞相比较，过表达CA916798引起PC9细胞对吉非替尼的IC50显著上升，由0.48μM提高至2.60μM（（p<0.001）（图3-4A）；而在另一株细胞HCC827细胞中过表达CA916798后，也使该细胞对埃克替尼的IC50显著提高，由0.06μM提高至1.42μM（p<0.001）（图3-4B）。以上结果说明过表达CA916798可显著提高敏感细胞对EGFR-TKIs的IC50，降低敏感细胞对EGFR-TKIs药物的敏感性。
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