hNrf1/TCF11对肝细胞癌生物学行为的影响及其相关机制研究
发布时间：2021-01-30 23:35
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范围内癌症相关死亡的常见原因。跨核膜抗氧化转录因子Nrf1（nuclear factor-erythroid 2 p45 submit-related factor 1）是Cnc-bZIP（cap‘n’collar basic-region leucine zipper）即Cnc碱性亮氨酸拉链亚家族成员之一,通过调控下游抗氧化酶、解毒酶、26s蛋白酶体亚基基因的转录,保护细胞和组织免受氧化应激的影响,引发细胞进行适应性变化以维持机体内平衡。研究证实在成年小鼠肝脏特异敲除Nrf1会诱发肝细胞癌[1,2]。O连接的N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc）单糖修饰是细胞为满足不同生物学功能需要,进行的快速、可逆、动态的蛋白质翻译后修饰,由体内的唯一的O-GlcNAc糖基转移酶（O-GlcNAc Transferase,OGT）催化进行。O-GlcNAc修饰的异常与肿瘤发生、迁移和侵袭过程密切相关,在肝细胞癌形成和发展中起着重要作用[3]。近期液相色谱-光谱法检测提示...
【文章来源】：重庆大学重庆市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：109 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
英文缩略词表
1 前言
1.1 国内外研究现状
1.1.1 肝细胞癌的概况
1.1.2 转录因子Nrf1研究进展
1.1.3 Wnt/β-Catenin信号通路与肝癌的侵袭和转移
1.1.4 O-GlcNAc修饰研究概况
1.2 课题的主要研究内容
1.3 本文创新点
2 敲减hNrf1/TCF11对肝癌生物学行为的影响
2.1 材料
2.1.1 细胞系
2.1.2 慢病毒载体
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
2.2.2 慢病毒包装及转导
2.2.3 Western Blot
2.2.4 MTT法绘制细胞生长曲线
2.2.5 克隆形成实验
2.2.6 流式细胞术检测细胞周期
2.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡
2.2.8 细胞体外迁移实验（细胞划痕实验）
2.2.9 细胞侵袭实验
2.3 实验结果
2.3.1 稳定敲减hNrf1/TCF11的HepG2、MHCC97H、MHCC97L肝癌细胞系的建立
2.3.2 稳定敲减hNrf1/TCF1对肝癌细胞系增殖的影响
2.3.3 敲减Nrf1对肝癌细胞迁移及侵袭力的作用
2.4 讨论
3 敲减hNrf1/TCF11对肝癌细胞侵袭影响的机制
3.1 材料
3.1.1 主要材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.2 实验方法
3.2.1 细胞培养
3.2.2 数字基因表达谱测序
3.2.3 细胞总RNA提取
3.2.4 反转录
3.2.5 qPCR实验
3.2.6 荧光素酶报告基因试验
3.2.7 Western-blot实验
3.2.8 放线菌酮追踪实验
3.2.9 泛素化实验
3.2.10 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提
3.2.11 裸鼠尾静脉注射肺部转移模型建立
3.2.12 SABC法免疫组织化学
3.3 实验结果
3.3.1 敲减hNrf1/TCF11能激活b-Catenin通路
3.3.2 敲减hNrf1能增加b-Catenin的核累积
3.3.3 敲减hNrf1/TCF11对裸鼠尾静脉荷瘤肺部转移的影响
3.4 讨论
4 O-Glc NAc修饰对Nrf1的影响及其在肝癌发生中的作用
4.1 材料
4.1.1 主要材料
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 细胞培养
4.2.2 细胞总RNA提取
4.2.3 反转录
4.2.4 Real-time PCR实验
4.2.5 Western-blot实验
4.2.6 GST-Pull-Down实验
4.2.7 荧光素酶报告基因试验
4.2.8 免疫共沉淀及泛素化实验
4.2.9 放线菌酮追踪实验
4.3 实实验结果
4.3.1 细胞内O-GlcNAc状态能影响hNrf1/TCF11的丰度
4.3.2 OGT与Nrf1在体外、细胞内均能相互作用
4.3.3 敲减OGT能增加Nrf1及其靶基因的表达
4.3.4 过表达OGT能减少Nrf1的表达并降低其转录活性
4.3.5 O-GlcNAc能影响Nrf1的泛素化降解
4.3.6 O-GlcNAc可能修饰Nrf1的区域
4.4 讨论
5 主要结论与后续研究
5.1 主要结论
5.2 后续研究
致谢
参考文献
附录
A 作者在攻读博士学位期间发表的论文
B 作者在攻读博士学位期间参加的科研项目
C 实时定量PCR引物序列表
【参考文献】：
期刊论文
[1]Sonic Hedgehog signaling pathway in primary liver cancer cells[J]. Lian-Yi Guo,Pei Liu,Ying Wen,Wei Cui,Ying Zhou. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2014(09)
本文编号：3009785
【文章来源】：重庆大学重庆市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：109 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
英文缩略词表
1 前言
1.1 国内外研究现状
1.1.1 肝细胞癌的概况
1.1.2 转录因子Nrf1研究进展
1.1.3 Wnt/β-Catenin信号通路与肝癌的侵袭和转移
1.1.4 O-GlcNAc修饰研究概况
1.2 课题的主要研究内容
1.3 本文创新点
2 敲减hNrf1/TCF11对肝癌生物学行为的影响
2.1 材料
2.1.1 细胞系
2.1.2 慢病毒载体
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
2.2.2 慢病毒包装及转导
2.2.3 Western Blot
2.2.4 MTT法绘制细胞生长曲线
2.2.5 克隆形成实验
2.2.6 流式细胞术检测细胞周期
2.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡
2.2.8 细胞体外迁移实验（细胞划痕实验）
2.2.9 细胞侵袭实验
2.3 实验结果
2.3.1 稳定敲减hNrf1/TCF11的HepG2、MHCC97H、MHCC97L肝癌细胞系的建立
2.3.2 稳定敲减hNrf1/TCF1对肝癌细胞系增殖的影响
2.3.3 敲减Nrf1对肝癌细胞迁移及侵袭力的作用
2.4 讨论
3 敲减hNrf1/TCF11对肝癌细胞侵袭影响的机制
3.1 材料
3.1.1 主要材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.2 实验方法
3.2.1 细胞培养
3.2.2 数字基因表达谱测序
3.2.3 细胞总RNA提取
3.2.4 反转录
3.2.5 qPCR实验
3.2.6 荧光素酶报告基因试验
3.2.7 Western-blot实验
3.2.8 放线菌酮追踪实验
3.2.9 泛素化实验
3.2.10 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提
3.2.11 裸鼠尾静脉注射肺部转移模型建立
3.2.12 SABC法免疫组织化学
3.3 实验结果
3.3.1 敲减hNrf1/TCF11能激活b-Catenin通路
3.3.2 敲减hNrf1能增加b-Catenin的核累积
3.3.3 敲减hNrf1/TCF11对裸鼠尾静脉荷瘤肺部转移的影响
3.4 讨论
4 O-Glc NAc修饰对Nrf1的影响及其在肝癌发生中的作用
4.1 材料
4.1.1 主要材料
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 细胞培养
4.2.2 细胞总RNA提取
4.2.3 反转录
4.2.4 Real-time PCR实验
4.2.5 Western-blot实验
4.2.6 GST-Pull-Down实验
4.2.7 荧光素酶报告基因试验
4.2.8 免疫共沉淀及泛素化实验
4.2.9 放线菌酮追踪实验
4.3 实实验结果
4.3.1 细胞内O-GlcNAc状态能影响hNrf1/TCF11的丰度
4.3.2 OGT与Nrf1在体外、细胞内均能相互作用
4.3.3 敲减OGT能增加Nrf1及其靶基因的表达
4.3.4 过表达OGT能减少Nrf1的表达并降低其转录活性
4.3.5 O-GlcNAc能影响Nrf1的泛素化降解
4.3.6 O-GlcNAc可能修饰Nrf1的区域
4.4 讨论
5 主要结论与后续研究
5.1 主要结论
5.2 后续研究
致谢
参考文献
附录
A 作者在攻读博士学位期间发表的论文
B 作者在攻读博士学位期间参加的科研项目
C 实时定量PCR引物序列表
【参考文献】：
期刊论文
[1]Sonic Hedgehog signaling pathway in primary liver cancer cells[J]. Lian-Yi Guo,Pei Liu,Ying Wen,Wei Cui,Ying Zhou. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2014(09)
本文编号：3009785
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/3009785.html
