β1整合素和CD146在半乳凝集素-3诱导血管内皮细胞迁移中的作用和机制
发布时间：2021-01-31 00:24
恶性肿瘤作为全球最大的公共卫生问题之一,极大地危害着人类健康,而血管形成对肿瘤的发生及发展起着至关重要的作用。半乳凝集素-3（Galectin-3,简称Gal-3）,作为半乳凝集素家族唯一嵌合体成员,具有多种功能,尤其是在促血管形成方面。目前,关于Gal-3促血管形成的研究已报道了几个受体,但并不能完全解释清楚Gal-3促血管形成的机制。内皮细胞迁移是血管形成的关键,因此本论文利用人表皮微血管内皮细胞HMEC-1,从功能受体及其作用机制两方面研究了Gal-3对HMEC-1迁移的影响及机制,研究结果和创新点如下:第一,利用Transwell细胞迁移方法,检测了Gal-3及其截短蛋白对HMEC-1细胞迁移的影响,发现Gal-3（1-250 aa）以糖依赖的方式促进细胞迁移。首次发现Gal-3的C-端（111-250 aa,Carbohydrate Recognition Domain,CRD）也以相同的方式促进细胞迁移,而单独的N-端（1-108 aa,N-terminal tail,NT）对细胞迁移无影响。此外,还发现Gal-3和CRD不论是在游离态,还是固定态,均能促进细胞迁移且作用相...
【文章来源】：东北师范大学吉林省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文对照及英文缩写词表
第一章 前言
1.1 半乳凝集素
1.2 半乳凝集素-3概述
1.3 Gal-3的结构
1.4 Gal-3的修饰、分布及存在形式
1.5 Gal-3的功能
1.5.1 Gal-3在肿瘤发生、发展及转移中的作用
1.5.2 Gal-3在细胞凋亡中的作用
1.5.3 Gal-3在细胞增殖和分化中的作用
1.5.4 Gal-3在细胞黏附中的作用
1.5.5 Gal-3在血管形成及血管内皮细胞迁移中的作用
1.5.6 CRD功能概述
1.6 Gal-3受体
1.6.1 Integrin简介
1.6.2 免疫球蛋白超家族及CD146简介
1.7 论文立题依据、研究内容、目的及意义
第二章 Gal-3对HMEC-1细胞迁移的影响及相关受体筛选
2.1 材料、试剂和设备
2.1.1 材料
2.1.2 主要试剂和配制
2.1.3 主要仪器和耗材
2.2 实验方法
2.2.1 感受态细胞的制备
2.2.2 pET-28a（+）-Gal-3,pET-28a（+）-CRD和pET-28a（+）-NT质粒的构建
2.2.3 蛋白质的大量制备
2.2.4 细胞的复苏
2.2.5 细胞培养及传代
2.2.6 细胞冻存
2.2.7 蛋白定量及SDS-PAGE和WesternBlot实验
2.2.8 细胞迁移
2.2.9 慢病毒载体的构建
2.2.10 慢病毒的包装
2.2.11 目的细胞的感染
2.2.12 细胞膜分离
2.2.13 免疫共沉淀法
2.2.14 硝酸银染色法及质谱检测
2.2.15 数据统计及分析
2.3 结果
2.3.1 His-Gal-3、His-CRD和His-NT蛋白的纯化结果
2.3.2 Gal-3对HMEC-1细胞迁移的影响
2.3.3 Gal-3不同截短蛋白对HMEC-1细胞迁移的影响
2.3.4 CRD对HMEC-1细胞迁移的影响
2.3.5 Gal-3和CRD促进HMEC-1细胞迁移具有细胞密度依赖性
2.3.6 游离态和固定态的Gal-3和CRD对HMEC-1细胞迁移的影响
2.3.7 LPS对Gal-3和CRD诱导HMEC-1细胞迁移的影响
2.3.8 .αvintegrin在Gal-3诱导细胞迁移中的作用
2.3.9 EGFR和VEGFR2在Gal-3诱导HMEC-1细胞迁移中的作用
2.3.10 筛选HMEC-1细胞膜上未知的Gal-3受体
2.3.11 质谱分析结果
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 β1integrin在Gal-3和CRD诱导HMEC-1迁移中的作用及机制
3.1 材料、试剂及仪器
3.1.1 材料
3.1.2 主要试剂及配制
3.1.3 主要仪器和耗材
3.2 实验方法
3.2.1 感受态细胞的制备
3.2.2 GST、GST-Gal-3及GST-CRD蛋白的制备
3.2.3 慢病毒质粒的构建
3.2.4 慢病毒的包装
3.2.5 目的细胞的感染
3.2.6 免疫印迹实验
3.2.7 细胞迁移及数据统计
3.2.8 Pulldown方法
3.2.9 数据统计及分析
3.3 结果
3.3.1 Gal-3和CRD与β1integrin作用
3.3.2 β1integrin在Gal-3和CRD诱导HMEC-1细胞迁移中的作用
3.3.3 敲低β1integrin对αintegrin亚基表达的影响
3.3.4 αintegrin亚基与Gal-3的相互作用
3.3.5 αintegrin亚基在Gal-3及CRD诱导HMEC-1细胞迁移中的作用
3.3.6 β1integrin在Gal-3和CRD诱导HMEC-1迁移的作用机制研究
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 CD146在Gal-3诱导HMEC-1细胞迁移中的作用及与Gal-3作用的分子机制
4.1 材料、试剂及仪器
4.1.1 材料
4.1.2 主要试剂及配制
4.1.3 主要仪器及耗材
4.2 实验方法
4.2.1 细胞复苏
4.2.2 细胞培养及传代
4.2.3 细胞冻存
4.2.4 CD146胞外段及其胞外段截短蛋白的大量制备
4.2.5 质谱分析CD146的糖基化位点及糖型
4.2.6 Pulldown方法检测CD146与Gal-3及CRD的直接作用
4.2.7 生物膜干涉法检测CD146与Gal-3的亲和力大小
4.2.8 免疫共沉淀法检测CD146及D1-D4蛋白与Gal-3的作用
4.2.9 慢病毒包装
4.2.10 RT-PCR
4.2.11 细胞迁移及数据统计分析
4.3 结果
4.3.1 CD146在Gal-3诱导HMEC-1细胞迁移中的作用
4.3.2 Gal-3对CD146mRNA表达的影响
4.3.3 Gal-3对CD146蛋白表达的影响
4.3.4 Gal-3对CD146蛋白二聚化的影响
4.3.5 CD146与Gal-3的相互作用
4.3.6 CD146蛋白的表达及纯化
4.3.7 CD146蛋白在溶液中的存在形态
4.3.8 CD146与Gal-3在分子水平的作用
4.3.9 CD146胞外段截短蛋白的表达及纯化
4.3.10 D1-D4蛋白在溶液中的存在形态
4.3.11 Domain5是CD146与Gal-3作用的关键结构域
4.3.12 CD146胞外段蛋白的糖基化位点
4.3.13 CD146胞外段蛋白的糖链分析
4.4 讨论
4.5 小结
全文总结
参考文献
致谢
博士期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]Knockdown of CD146 reduces the migration and proliferation of human endothelial cells[J]. Yanyong Kang~(1,3) Fengcai Wang~(1,2) Jing Feng~1 Dongling Yang~1 Xu Yang~3 Xiyun Yan~11 National Laboratory of Biomacromolecules,Institute of Biophysics,Chinese Academy of Science Beijing 100101,China;2 Chemistry Department,Anyang teacher’s College,Anyang 455000,China;3 College of Life Science,Central China Normal University,Wuhan 430079,China. Cell Research. 2006(03)
本文编号：3009860
【文章来源】：东北师范大学吉林省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文对照及英文缩写词表
第一章 前言
1.1 半乳凝集素
1.2 半乳凝集素-3概述
1.3 Gal-3的结构
1.4 Gal-3的修饰、分布及存在形式
1.5 Gal-3的功能
1.5.1 Gal-3在肿瘤发生、发展及转移中的作用
1.5.2 Gal-3在细胞凋亡中的作用
1.5.3 Gal-3在细胞增殖和分化中的作用
1.5.4 Gal-3在细胞黏附中的作用
1.5.5 Gal-3在血管形成及血管内皮细胞迁移中的作用
1.5.6 CRD功能概述
1.6 Gal-3受体
1.6.1 Integrin简介
1.6.2 免疫球蛋白超家族及CD146简介
1.7 论文立题依据、研究内容、目的及意义
第二章 Gal-3对HMEC-1细胞迁移的影响及相关受体筛选
2.1 材料、试剂和设备
2.1.1 材料
2.1.2 主要试剂和配制
2.1.3 主要仪器和耗材
2.2 实验方法
2.2.1 感受态细胞的制备
2.2.2 pET-28a（+）-Gal-3,pET-28a（+）-CRD和pET-28a（+）-NT质粒的构建
2.2.3 蛋白质的大量制备
2.2.4 细胞的复苏
2.2.5 细胞培养及传代
2.2.6 细胞冻存
2.2.7 蛋白定量及SDS-PAGE和WesternBlot实验
2.2.8 细胞迁移
2.2.9 慢病毒载体的构建
2.2.10 慢病毒的包装
2.2.11 目的细胞的感染
2.2.12 细胞膜分离
2.2.13 免疫共沉淀法
2.2.14 硝酸银染色法及质谱检测
2.2.15 数据统计及分析
2.3 结果
2.3.1 His-Gal-3、His-CRD和His-NT蛋白的纯化结果
2.3.2 Gal-3对HMEC-1细胞迁移的影响
2.3.3 Gal-3不同截短蛋白对HMEC-1细胞迁移的影响
2.3.4 CRD对HMEC-1细胞迁移的影响
2.3.5 Gal-3和CRD促进HMEC-1细胞迁移具有细胞密度依赖性
2.3.6 游离态和固定态的Gal-3和CRD对HMEC-1细胞迁移的影响
2.3.7 LPS对Gal-3和CRD诱导HMEC-1细胞迁移的影响
2.3.8 .αvintegrin在Gal-3诱导细胞迁移中的作用
2.3.9 EGFR和VEGFR2在Gal-3诱导HMEC-1细胞迁移中的作用
2.3.10 筛选HMEC-1细胞膜上未知的Gal-3受体
2.3.11 质谱分析结果
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 β1integrin在Gal-3和CRD诱导HMEC-1迁移中的作用及机制
3.1 材料、试剂及仪器
3.1.1 材料
3.1.2 主要试剂及配制
3.1.3 主要仪器和耗材
3.2 实验方法
3.2.1 感受态细胞的制备
3.2.2 GST、GST-Gal-3及GST-CRD蛋白的制备
3.2.3 慢病毒质粒的构建
3.2.4 慢病毒的包装
3.2.5 目的细胞的感染
3.2.6 免疫印迹实验
3.2.7 细胞迁移及数据统计
3.2.8 Pulldown方法
3.2.9 数据统计及分析
3.3 结果
3.3.1 Gal-3和CRD与β1integrin作用
3.3.2 β1integrin在Gal-3和CRD诱导HMEC-1细胞迁移中的作用
3.3.3 敲低β1integrin对αintegrin亚基表达的影响
3.3.4 αintegrin亚基与Gal-3的相互作用
3.3.5 αintegrin亚基在Gal-3及CRD诱导HMEC-1细胞迁移中的作用
3.3.6 β1integrin在Gal-3和CRD诱导HMEC-1迁移的作用机制研究
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 CD146在Gal-3诱导HMEC-1细胞迁移中的作用及与Gal-3作用的分子机制
4.1 材料、试剂及仪器
4.1.1 材料
4.1.2 主要试剂及配制
4.1.3 主要仪器及耗材
4.2 实验方法
4.2.1 细胞复苏
4.2.2 细胞培养及传代
4.2.3 细胞冻存
4.2.4 CD146胞外段及其胞外段截短蛋白的大量制备
4.2.5 质谱分析CD146的糖基化位点及糖型
4.2.6 Pulldown方法检测CD146与Gal-3及CRD的直接作用
4.2.7 生物膜干涉法检测CD146与Gal-3的亲和力大小
4.2.8 免疫共沉淀法检测CD146及D1-D4蛋白与Gal-3的作用
4.2.9 慢病毒包装
4.2.10 RT-PCR
4.2.11 细胞迁移及数据统计分析
4.3 结果
4.3.1 CD146在Gal-3诱导HMEC-1细胞迁移中的作用
4.3.2 Gal-3对CD146mRNA表达的影响
4.3.3 Gal-3对CD146蛋白表达的影响
4.3.4 Gal-3对CD146蛋白二聚化的影响
4.3.5 CD146与Gal-3的相互作用
4.3.6 CD146蛋白的表达及纯化
4.3.7 CD146蛋白在溶液中的存在形态
4.3.8 CD146与Gal-3在分子水平的作用
4.3.9 CD146胞外段截短蛋白的表达及纯化
4.3.10 D1-D4蛋白在溶液中的存在形态
4.3.11 Domain5是CD146与Gal-3作用的关键结构域
4.3.12 CD146胞外段蛋白的糖基化位点
4.3.13 CD146胞外段蛋白的糖链分析
4.4 讨论
4.5 小结
全文总结
参考文献
致谢
博士期间发表论文情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]Knockdown of CD146 reduces the migration and proliferation of human endothelial cells[J]. Yanyong Kang~(1,3) Fengcai Wang~(1,2) Jing Feng~1 Dongling Yang~1 Xu Yang~3 Xiyun Yan~11 National Laboratory of Biomacromolecules,Institute of Biophysics,Chinese Academy of Science Beijing 100101,China;2 Chemistry Department,Anyang teacher’s College,Anyang 455000,China;3 College of Life Science,Central China Normal University,Wuhan 430079,China. Cell Research. 2006(03)
本文编号：3009860
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