帕唑帕尼影响肺癌表达谱和miRNA谱的联合分析和代谢研究

发布时间：2021-02-14 19:46

　　背景和目的:肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,死亡率无论在中国还是世界范围内均排恶性肿瘤的第一位,且仍呈上升趋势。在肿瘤的发生发展过程中,大多会表现一系列共有的特征,包括:持续性的增值信号、逃逸生长抑制因子、抵抗细胞死亡及永生化、激活侵袭转移和促进血管生成。针对肿瘤的血管生成,目前已经开发有针对VEGF及其受体的单克隆抗体还有帕唑帕尼等受体酪氨酸激酶抑制剂等。临床前研究确认帕唑帕尼等酪氨酸酶抑制剂具有明确的抑制肿瘤增殖、内皮细胞成管和抑制移植瘤增殖的作用,但临床研究发现其总体生存期等指标较对照组提升不明显,尚需对帕唑帕尼等抑制剂的作用机制和细胞耐受反应进行深入的研究。方法:（1）本研究选择多种非小细胞肺癌细胞系A549、H460、L9981和YTMLC-90作为实验对象。（2）应用MTT法探究帕唑帕尼对个细胞株合适的干预剂量范围和时间。（3）利用流式细胞术、划痕实验、transwell侵袭实验探究帕唑帕尼对肺癌细胞周期分布、迁移及侵袭能力的影响。（4）提取10μM帕唑帕尼干预组和溶剂对照组帕唑帕尼的总RNA进行表达谱和miRNA谱的芯片检测,筛选出各细胞株之间变化趋势相同的差异表达... 

【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校

【文章页数】：163 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
abstract
缩略语/符号说明
前言
    研究现状、成果
    研究目的、方法
一、帕唑帕尼对肺癌增殖和转移能力的体外研究
    1.1 实验材料
        1.1.1 细胞株
        1.1.2 主要试剂和材料
        1.1.3 主要仪器
        1.1.4 试剂配制
    1.2 实验方法
        1.2.1 细胞培养
        1.2.2 MTT检测帕唑帕尼对A549,H460,L9981和YTMLC-90的抑制作用。
        1.2.3 细胞生长曲线的测定
        1.2.4 细胞周期的测定
        1.2.5 细胞迁移能力检测
        1.2.6 Transwell侵袭实验
    1.3 结果
        1.3.1 A549、H460、L9981和YTMLC-90生长曲线和倍增时间
        1.3.2 药物抑制率
        1.3.3 pazopanib对周期的影响
        1.3.4 pazopanib对细胞迁移能力的影响
        1.3.5 pazopanib对细胞侵袭能力的影响
    1.4 讨论
        1.4.1 帕唑帕尼的理化性质
        1.4.2 帕唑帕尼对各细胞株存活率的抑制实验
        1.4.3 帕唑帕尼对细胞迁移能力的影响
        1.4.4 帕唑帕尼对侵袭能力的影响
        1.4.5 帕唑帕尼对非小细胞肺癌周期的影响
    1.5 小结
二、帕唑帕尼作用于多种非小细胞肺癌的表达谱和miRNA谱改变的检测和验证
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞株
        2.1.2 主要试剂盒材料
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 细胞收集和总RNA制备
        2.2.2 RNA定量和质检
        2.2.3 芯片杂交
        2.2.4 芯片洗涤
        2.2.5 芯片扫描及数据采集
        2.2.6 芯片数据处理和分析
        2.2.7 实时定量引物设计
        2.2.8 RealtimePCR
    2.3 实验结果
        2.3.1 用于miRNA芯片的RNA质检
        2.3.2 miRNA芯片结果
        2.3.3 差异表达miRNA-mRNA关系及网络图
        2.3.4 差异表达基因的realtimePCR验证
        2.3.5 差异表达miRNA的realtimePCR验证
    2.4 讨论
    2.5 结论
三、糖代谢相关基因PCK2的验证和功能的初步研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞株
        3.1.2 主要试剂和材料
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 试剂配置
    3.2 实验方法
        3.2.1 PCK2过表达载体的构建
        3.2.2 RNAoligo序列和订购
        3.2.3 质粒及oligo转染
        3.2.4 RealtimePCR检测PCK2siRNAs干扰效率
        3.2.5 WesternBlot检测PCK2过表达载体及PCK2siRNAs在蛋白水平对PCK2表达的影响
        3.2.6 转染PCK2siRNAs及过表达质粒对细胞增殖的影响
        3.2.7 PCK2基因对细胞周期水平的影响
        3.2.8 PCK2基因对低糖高乳酸环境下细胞葡萄糖消耗及乳酸生成水平的影响
    3.3 实验结果
        3.3.1 realtimePCR验证PCK2siRNA干扰效果,探究miR-1233-5p、miR-1307-5p与其的关系
        3.3.2 WesternBlot检测帕唑帕尼对PCK2的诱导作用,及验证PCK2-pEGFP过表达效果
        3.3.3 转染PCK2siRNAs及过表达质粒对周期的影响。
        3.3.4 转染PCK2siRNAs或帕唑帕尼干预对A549在条件培养环境下葡萄糖的消耗和乳酸生成的影响
        3.3.5 转染PCK2siRNAs及过表达质粒对细胞增殖的影响
        3.3.6 转染PCK2过表达质粒对帕唑帕尼药物抑制率的影响
    3.4 讨论
        3.4.1 改变PCK2表达水平对培养环境中乳酸和葡萄糖的影响
        3.4.2 改变PCK2表达水平对细胞增殖能力的影响
        3.4.3 改变PCK2表达水平对帕唑帕尼对A549抑制能力的影响
    3.5 小结
四、PTEN对多种抗肿瘤药物的单药和联合作用的影响
    4.1 实验材料
        4.1.1 细胞株
        4.1.2 主要试剂和材料
        4.1.3 主要仪器
        4.1.4 主要试剂配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 接种细胞
        4.2.2 稀释药物
        4.2.3 加5mg/mlMTT溶液并酶标仪上机检测
        4.2.4 计算细胞抑制率和联合干预的相关参数
    4.3 结果
        4.3.1 单药作用48小时对成组细胞株：MEFWT、MEFPTEN-/-,HCT116WT、HCTPTENKO35细胞的抑制作用
        4.3.2 双药物联合对作用48小时对成组细胞株：MEFWT、MEFPTEN-/-,HCT116WT、HCT116PTENKO35细胞的抑制作用
    4.4 讨论
    4.5 小结
全文结论
论文创新点
发表论文和参加科研情况说明
附录
参考文献
综述
    Reference
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]MiR-192靶向负调控Bim表达诱导肺癌顺铂耐药[J]. 张芳,李洋,吴蘅,齐康,尤嘉琮,李雪冰,祖玲玲,潘振华,王玉丽,李永文,李颖,王珉,沈旺,周清华.  中国肺癌杂志. 2014(05)
[2]肺癌细胞侵袭过程中蛋白分解酶的作用[J]. 沈晓鸣,黄炜,黄济群.  广东医学院学报. 2001(02)



本文编号：3033754