肾癌细胞外泌体在肾癌肺转移中的功能及机制研究
发布时间：2021-03-29 01:05
研究目的肾细胞癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,其发病率长期处于增长态势。2018年全球肾癌新发病例约40万,死亡病例约17万;在中国肾癌新发病例约7万,死亡病例约4.3万。肾癌患者中约有30%初诊时已发生转移,还有约25%局限性肾癌患者术后会出现局部复发或远处转移,转移部位以肺部最为常见。目前转移性肾癌患者的治疗手段仍然有限,预后亦较差,肾癌发生远处转移的分子生物学机制仍不清楚。近来研究表明肿瘤细胞来源的外泌体能通过介导转移前微环境形成,从而在肿瘤转移过程中发挥着重要作用,但是肾癌细胞外泌体是否能够通过介导肺转移前微环境形成进而影响肾癌肺转移过程,相关分子机制如何,目前仍有待阐明。本研究拟探讨肾癌细胞外泌体在肾癌肺转移过程中的功能以及相关分子机制,为肾癌肺转移患者寻找新的潜在诊断标志物以及干预靶点提供理论依据。研究方法1.采用超速离心方法提取低转移性肾癌细胞786-O和高转移性肾癌细胞SN12-PM6来源的外泌体,标记为786-O-exo和SN12-PM6-exo,利用NTA（nanoparticle tracking analysis）、透射电镜以及蛋白免疫印迹等方法对外泌体进行鉴定分析...
【文章来源】：中国人民解放军海军军医大学上海市 211工程院校
【文章页数】：109 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
1肾癌细胞外泌体的鉴定分析A.NTA分析786-O和SN12-PM6肾癌细胞外泌
肾癌细胞外泌体在肾癌肺转移中的功能及机制研究-33-体的大小分布情况以及外泌体浓度；exo为外泌体exosomes的简写形式。B.透射电镜分析肾癌细胞外泌体的形态和大校C.Westernblot检测肾癌细胞及其分泌的外泌体中Alix、TSG101以及CD63等外泌体特征性蛋白分子的表达情况。D.相同数目的高转移性和低转移性肾癌细胞分泌的外泌体样本总蛋白含量的比较。Figure1.1.1IdentificationandanalysisofexosomesderivedfromRCCcellsA.AnalysisoftheparticlessizedistributionandconcentrationsofexosomesderivedfromRCCcellsbyNTA;exoindicatesexosomes.B.TransmissionelectronmicroscopeanalysisofthemorphologyandsizeofexosomesderivedfromRCCcells.C.WesternblotanalysisoftheexpressionofAlix,TSG101andCD63inRCCcellsandtheirexosomes.D.ComparisonoftotalproteinlevelsofexosomesamplessecretedbythesamenumberofhighlymetastaticandlowmetastaticRCCcells;RCC,renalcellcarcinoma.接着，为了验证肾癌细胞外泌体在肺部的分布情况，我们经小鼠尾静脉注入荧光染料PKH67标记后的肾癌细胞外泌体溶液，然后分别在0、24、48小时后取出小鼠肺组织，利用荧光成像系统检测肾癌细胞外泌体在肺组织中的分布情况。结果发现在肾癌细胞外泌体注入小鼠体内24及48小时之后均可在肺部观察到明显荧光信号（图1.1.2），这提示肾癌细胞外泌体能够通过血液循环在肺部明显富集。图1.1.2荧光成像系统动态检测肾癌细胞外泌体在肺部的分布情况Figure1.1.2ThedistributionofPKH67-labeledexosomesderivedfromRCCcellsinthelungswasdynamicallytracedbyexvivofluorescentimagingsystem.
肾癌细胞外泌体在肾癌肺转移中的功能及机制研究-34-由于外泌体主要通过传递其内容物至受体细胞介导细胞间的信息交流，因此，接下来我们将探索肺组织中摄取肾癌细胞外泌体的细胞类型。首先，我们通过荧光共定位实验分析肺组织中各类细胞摄取肾癌细胞外泌体的情况。经小鼠尾静脉注入荧光染料PKH67标记后的肾癌细胞外泌体溶液，24小时后即取出小鼠肺组织制成肺组织快速冰冻切片，然后进行免疫荧光实验检测肺组织中EpCAM+肺上皮细胞、CD31+内皮细胞、S100A4+成纤维细胞以及F4/80+巨噬细胞等多种细胞对肾癌细胞外泌体的摄取情况。通过荧光共聚焦显微镜观察，我们发现其中S100A4+肺成纤维细胞（红色荧光）能够摄取绿色荧光标记的肾癌细胞外泌体，而其他三种细胞中均未见摄取的外泌体荧光信号（图1.1.3A）。接着，为了进一步明确肺成纤维细胞对肾癌细胞外泌体的摄取，我们进行了体外外泌体摄取实验。将绿色荧光染料PHK67标记肾癌细胞外泌体溶液SN12-PM6-exo和786-O-exo，然后分别加入红色荧光染料PKH26标记的人肺成纤维细胞MRC-5的培养基中，24小时后通过荧光共聚焦显微镜观察发现SN12-PM6-exo和786-O-exo均能被肺成纤维细胞MRC-5摄取（图1.1.3B）。因此，上述体内和体外外泌体摄取实验结果表明肺成纤维细胞可能为肺组织中摄取肾癌细胞外泌体的主要细胞类型。图1.1.3肾癌细胞外泌体被肺成纤维细胞摄取A.荧光共聚焦显微镜观察肺组织冰冻切
本文编号：3106592
【文章来源】：中国人民解放军海军军医大学上海市 211工程院校
【文章页数】：109 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
1肾癌细胞外泌体的鉴定分析A.NTA分析786-O和SN12-PM6肾癌细胞外泌
肾癌细胞外泌体在肾癌肺转移中的功能及机制研究-33-体的大小分布情况以及外泌体浓度；exo为外泌体exosomes的简写形式。B.透射电镜分析肾癌细胞外泌体的形态和大校C.Westernblot检测肾癌细胞及其分泌的外泌体中Alix、TSG101以及CD63等外泌体特征性蛋白分子的表达情况。D.相同数目的高转移性和低转移性肾癌细胞分泌的外泌体样本总蛋白含量的比较。Figure1.1.1IdentificationandanalysisofexosomesderivedfromRCCcellsA.AnalysisoftheparticlessizedistributionandconcentrationsofexosomesderivedfromRCCcellsbyNTA;exoindicatesexosomes.B.TransmissionelectronmicroscopeanalysisofthemorphologyandsizeofexosomesderivedfromRCCcells.C.WesternblotanalysisoftheexpressionofAlix,TSG101andCD63inRCCcellsandtheirexosomes.D.ComparisonoftotalproteinlevelsofexosomesamplessecretedbythesamenumberofhighlymetastaticandlowmetastaticRCCcells;RCC,renalcellcarcinoma.接着，为了验证肾癌细胞外泌体在肺部的分布情况，我们经小鼠尾静脉注入荧光染料PKH67标记后的肾癌细胞外泌体溶液，然后分别在0、24、48小时后取出小鼠肺组织，利用荧光成像系统检测肾癌细胞外泌体在肺组织中的分布情况。结果发现在肾癌细胞外泌体注入小鼠体内24及48小时之后均可在肺部观察到明显荧光信号（图1.1.2），这提示肾癌细胞外泌体能够通过血液循环在肺部明显富集。图1.1.2荧光成像系统动态检测肾癌细胞外泌体在肺部的分布情况Figure1.1.2ThedistributionofPKH67-labeledexosomesderivedfromRCCcellsinthelungswasdynamicallytracedbyexvivofluorescentimagingsystem.
肾癌细胞外泌体在肾癌肺转移中的功能及机制研究-34-由于外泌体主要通过传递其内容物至受体细胞介导细胞间的信息交流，因此，接下来我们将探索肺组织中摄取肾癌细胞外泌体的细胞类型。首先，我们通过荧光共定位实验分析肺组织中各类细胞摄取肾癌细胞外泌体的情况。经小鼠尾静脉注入荧光染料PKH67标记后的肾癌细胞外泌体溶液，24小时后即取出小鼠肺组织制成肺组织快速冰冻切片，然后进行免疫荧光实验检测肺组织中EpCAM+肺上皮细胞、CD31+内皮细胞、S100A4+成纤维细胞以及F4/80+巨噬细胞等多种细胞对肾癌细胞外泌体的摄取情况。通过荧光共聚焦显微镜观察，我们发现其中S100A4+肺成纤维细胞（红色荧光）能够摄取绿色荧光标记的肾癌细胞外泌体，而其他三种细胞中均未见摄取的外泌体荧光信号（图1.1.3A）。接着，为了进一步明确肺成纤维细胞对肾癌细胞外泌体的摄取，我们进行了体外外泌体摄取实验。将绿色荧光染料PHK67标记肾癌细胞外泌体溶液SN12-PM6-exo和786-O-exo，然后分别加入红色荧光染料PKH26标记的人肺成纤维细胞MRC-5的培养基中，24小时后通过荧光共聚焦显微镜观察发现SN12-PM6-exo和786-O-exo均能被肺成纤维细胞MRC-5摄取（图1.1.3B）。因此，上述体内和体外外泌体摄取实验结果表明肺成纤维细胞可能为肺组织中摄取肾癌细胞外泌体的主要细胞类型。图1.1.3肾癌细胞外泌体被肺成纤维细胞摄取A.荧光共聚焦显微镜观察肺组织冰冻切
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