基于CRISPR/Cas9技术的荧光标记IFNGR2敲入细胞系构建

发布时间：2021-05-05 17:22

　　干扰素γ（IFNγ）信号通路在免疫反应、炎性反应、抗肿瘤免疫等过程中发挥至关重要的作用,其功能状态是决定肿瘤免疫治疗成败的关键。IFN-γ发挥作用主要是通过结合膜表面受体IFN-γR并激活其下游的信号分子,调节相关基因的转录和表达。IFN-γR由两种亚单位组成:IFNγR1（IFNGR1）和IFNγR2（IFNGR2）。IFNGR1在细胞中表达相对过剩,IFNGR2的表达受到机体严格的调控。IFNGR2的表达水平直接决定了IFNγ信号通路反应性,因此调控IFNGR2的表达是提高免疫治疗效果的潜在突破口,阐明IFNGR2的调控机制有助于深入理解IFNγ信号通路有关的免疫反应和疾病发生过程,具有潜在的临床意义。为了发现调控IFNGR2表达和IFNγ信号通路的基因、小分子化合物等,寻找研究其调控方式及其分子机制的新思路和新策略,本文采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在IFNGR2基因末端原位敲入融合表达的绿色荧光蛋白（EGFP）,建立IFNGR2报告细胞系,通过绿色荧光强度表征活细胞中内源IFNGR2的表达情况,实现对IFNGR2受调控程度的快速、通量化监测。我们采取了两种策略来实现E... 

【文章来源】：军事科学院北京市

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 肿瘤免疫治疗
    1.2 IFNγ信号通路与肿瘤免疫治疗
    1.3 基因编辑技术
    1.4 TNF-α和Oxaliplatin在肿瘤治疗的研究和应用
第二章 材料及方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞株及菌株
        2.1.2 质粒
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 试剂配制
    2.2 主要仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 载体的构建
        2.3.2 细胞复苏、传代与冻存
        2.3.3 细胞转染
        2.3.4 细胞嘌呤毒素的筛选浓度的确定
        2.3.5 细胞系Ifngr2-EGFP单克隆细胞系的筛选
        2.3.6 Ifngr2-EGFP敲入细胞系基因组水平的鉴定
        2.3.7 Ifngr2-EGFP敲入细胞蛋白质水平的鉴定
        2.3.8 敲入细胞系细胞因子和药物处理的功能性验证
        2.3.9 统计学检验
第三章 实验结果
    3.1 敲入位点的设计
        3.1.1 基因信息的获取
        3.1.2 sgRNA的设计及实验流程
    3.2 敲入载体的构建
        3.2.1 微同源末端连接法载体的构建
        3.2.2 同源重组法载体的构建
    3.3 敲入细胞系的筛选与鉴定
        3.3.1 细胞系构建和筛选方法的建立
        3.3.2 敲入细胞克隆的鉴定
    3.4 B16-Ifngr2-EGFP细胞系可以响应IFNγ刺激
    3.5 TNFα和Oxaliplatin促进B16 敲入细胞系Ifngr2 和EGFP表达
        3.5.1 TNFα上调Ifngr2和EGFP的表达
        3.5.2 奥沙利铂促进Ifngr2和EGFP的表达
        3.5.3 IFNγ不影响Ifngr2和EGFP的表达
第四章 讨论
参考文献
作者在学期间取得的学术成果
主要简历
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]肿瘤免疫治疗的研究现状及应用[J]. 王贝茹,张思远,魏陈秋.  中外医学研究. 2019(22)
[2]肿瘤免疫检查点抑制剂临床治疗的研究进展[J]. 许标波,贺毅憬,王韦力,周成芳,谢商宸,沈冬亚,Howard L.Mcleod.  中国临床药理学与治疗学. 2016(02)



本文编号：3170283