外周血循环肿瘤细胞的分离检测及其性质研究
发布时间：2021-05-16 01:58
循环肿瘤细胞（CTCs）是恶性肿瘤转移的根源,外周血中CTCs的分离和检测在肿瘤的早期诊断、疗效监测、耐药性监测、预后评估及个体化治疗等方面都具有重要意义。本文基于流体力学技术、膜过滤技术和免疫荧光染色技术搭建了一套CTCs盘式分离装置,建立了一套CTCs分离检测方法;根据肿瘤细胞回收率和白细胞残留率筛选了最适孔径的分离膜;以肺癌细胞A549为细胞模型,通过构建“A549+5 mL PBS检测体系”和“A549+5 mL健康人静脉血检测体系”,进行了方法学评价;将本文方法与韩国Clinomics公司的CD-PRIME设备进行了比较;并使用本文方法对临床患者血样进行了分离。结果表明:8μm孔径的分离膜为最适分离膜;本文建立的分离方法总体稳定性和重复性良好（CV<5%）;在5 mL PBS检测体系中,肿瘤细胞的回收率为73.59%±2.14%,最低可检测2个肿瘤细胞;在5 m L健康人静脉血检测体系中,肿瘤细胞的回收率为70.05%±5.89%,最低可检测3个肿瘤细胞,即本文方法分离CTCs的最低检测限为3个CTCs/5 mL外周血。本文建立的分离方法对肿瘤细胞的回收率（72.05%...
【文章来源】：长春理工大学吉林省
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略词对照表
第一章 绪论
1.1 循环肿瘤细胞(CTCs)概述
1.2 国内外研究进展
1.2.1 常见的CTCs富集与分离技术
1.2.2 常见的CTCs检测与分析技术
1.2.3 集富集分离与检测分析于一体的综合系统
1.3 研究的目的及意义
1.4 主要研究内容
第二章 CTCs分离设备的研究与开发
2.1 分离装置的设计及工作原理
2.1.1 分离仪
2.1.2 分离盘
2.1.3 分离膜
2.1.4 分离操作流程
2.2 图像识别软件的开发
2.3 本章小结
第三章 CTCs分离检测方法的建立及应用
3.1 实验仪器与材料
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要实验试剂
3.1.3 主要实验仪器
3.1.4 试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 CTCs分离检测方法的建立
3.2.2 不同孔径分离膜的筛选
3.2.3 富集液的优化
3.2.4 稳定性测试
3.2.5 重复性测试
3.2.6 PBS体系中肿瘤细胞回收率和检测限的测定
3.2.7 血液体系中肿瘤细胞回收率和检测限的测定
3.2.8 比对实验
3.2.9 临床血样中CTCs的分离筛选
3.3 实验结果
3.3.1 不同类型细胞分离染色结果
3.3.2 不同孔径分离膜的筛选结果
3.3.3 富集液的优化
3.3.4 稳定性测试
3.3.5 重复性测试
3.3.6 PBS体系中肿瘤细胞回收率和检测限的测定
3.3.7 血液体系中肿瘤细胞回收率和检测限的测定
3.3.8 比对实验
3.3.9 临床血样中CTCs的分离筛选
3.4 本章小结
第四章 肿瘤细胞中CK18基因mRNA表达量的检测
4.1 实验仪器与材料
4.1.1 实验材料
4.1.2 主要实验试剂
4.1.3 主要实验仪器
4.1.4 试剂配制
4.2 实验方法
4.2.1 静脉血中分离出的肺癌A549细胞的体外培养
4.2.2 细胞总RNA的提取
4.2.3 cDNA的合成
4.2.4 cDNA的鉴定
4.2.5 A549细胞中CK18基因mRNA表达量的检测
4.3 实验结果
4.3.1 静脉血中分离出的肺癌A549细胞的体外培养
4.3.2 总RNA的提取
4.3.3 cDNA普通PCR鉴定结果
4.3.4 CK18基因mRNA表达量检测结果
4.4 本章小结
第五章 肿瘤细胞中EGFR基因突变的检测
5.1 实验仪器与材料
5.1.1 实验材料
5.1.2 主要实验试剂
5.1.3 主要实验仪器
5.2 实验方法
5.2.1 EGFR基因序列
5.2.2 基于测序的EGFR基因突变检测
5.2.3 基于数字PCR的EGFR-T790M突变检测
5.2.4 基于数字PCR的EGFR-L858R突变检测
5.3 实验结果
5.3.1 A549细胞EGFR基因突变测序分析
5.3.2 基于微滴式数字PCR的T790M突变检测结果
5.3.3 基于微滴式数字PCR的L858R突变检测结果
5.4 本章小结
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
附录A CD-PRIME操作说明
攻读学位期间取得的成果
致谢
本文编号：3188744
【文章来源】：长春理工大学吉林省
【文章页数】：88 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩略词对照表
第一章 绪论
1.1 循环肿瘤细胞(CTCs)概述
1.2 国内外研究进展
1.2.1 常见的CTCs富集与分离技术
1.2.2 常见的CTCs检测与分析技术
1.2.3 集富集分离与检测分析于一体的综合系统
1.3 研究的目的及意义
1.4 主要研究内容
第二章 CTCs分离设备的研究与开发
2.1 分离装置的设计及工作原理
2.1.1 分离仪
2.1.2 分离盘
2.1.3 分离膜
2.1.4 分离操作流程
2.2 图像识别软件的开发
2.3 本章小结
第三章 CTCs分离检测方法的建立及应用
3.1 实验仪器与材料
3.1.1 实验材料
3.1.2 主要实验试剂
3.1.3 主要实验仪器
3.1.4 试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 CTCs分离检测方法的建立
3.2.2 不同孔径分离膜的筛选
3.2.3 富集液的优化
3.2.4 稳定性测试
3.2.5 重复性测试
3.2.6 PBS体系中肿瘤细胞回收率和检测限的测定
3.2.7 血液体系中肿瘤细胞回收率和检测限的测定
3.2.8 比对实验
3.2.9 临床血样中CTCs的分离筛选
3.3 实验结果
3.3.1 不同类型细胞分离染色结果
3.3.2 不同孔径分离膜的筛选结果
3.3.3 富集液的优化
3.3.4 稳定性测试
3.3.5 重复性测试
3.3.6 PBS体系中肿瘤细胞回收率和检测限的测定
3.3.7 血液体系中肿瘤细胞回收率和检测限的测定
3.3.8 比对实验
3.3.9 临床血样中CTCs的分离筛选
3.4 本章小结
第四章 肿瘤细胞中CK18基因mRNA表达量的检测
4.1 实验仪器与材料
4.1.1 实验材料
4.1.2 主要实验试剂
4.1.3 主要实验仪器
4.1.4 试剂配制
4.2 实验方法
4.2.1 静脉血中分离出的肺癌A549细胞的体外培养
4.2.2 细胞总RNA的提取
4.2.3 cDNA的合成
4.2.4 cDNA的鉴定
4.2.5 A549细胞中CK18基因mRNA表达量的检测
4.3 实验结果
4.3.1 静脉血中分离出的肺癌A549细胞的体外培养
4.3.2 总RNA的提取
4.3.3 cDNA普通PCR鉴定结果
4.3.4 CK18基因mRNA表达量检测结果
4.4 本章小结
第五章 肿瘤细胞中EGFR基因突变的检测
5.1 实验仪器与材料
5.1.1 实验材料
5.1.2 主要实验试剂
5.1.3 主要实验仪器
5.2 实验方法
5.2.1 EGFR基因序列
5.2.2 基于测序的EGFR基因突变检测
5.2.3 基于数字PCR的EGFR-T790M突变检测
5.2.4 基于数字PCR的EGFR-L858R突变检测
5.3 实验结果
5.3.1 A549细胞EGFR基因突变测序分析
5.3.2 基于微滴式数字PCR的T790M突变检测结果
5.3.3 基于微滴式数字PCR的L858R突变检测结果
5.4 本章小结
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 展望
参考文献
附录A CD-PRIME操作说明
攻读学位期间取得的成果
致谢
本文编号：3188744
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