mtSSB介导的线粒体发生通过激活端粒酶促进结直肠癌细胞生长

发布时间：2021-05-18 16:45

　　【背景】结直肠癌的发病率位居我国恶性肿瘤第三位,发病率呈现逐年上升趋势,且发病年龄逐步年轻化。在我国结直肠癌患者的5年生存率为65%,但当早期发现和早期治疗时,5年生存率上升到90%。当前临床上常见的结直肠镜检查难以发现早期癌。而且,常见结直肠癌的血清诊断标志物CEA和CA199特异性和敏感性难以令人满意。因此,大力加强结直肠癌基础研究,筛选鉴定新的诊断结直肠癌分子标志物并阐明其影响结直肠癌发生发展的病理机制,对于建立新的防治策略,显得尤为重要。线粒体是真核细胞重要的细胞器,在能量供应、ROS产生、信号转导以及细胞凋亡方面发挥关键作用。越来越多的研究证实线粒体在肿瘤的发生进展中起着非常重要的作用。线粒体参与肿瘤细胞的增值、侵袭转移以及凋亡等多种恶性表型。肿瘤与线粒体相关研究依然成为肿瘤研究领域的热点问题。线粒体生物发生和质量控制通常在癌症中上调以适应外界环境改变。很多研究表明在肿瘤中线粒体通过线粒体发生实现对肿瘤恶性表型的调控。因此,线粒体发生有望成为肿瘤防治的靶点。线粒体单链DNA结合蛋白（mtSSB）具有促进mtDNA复制和损伤修复,进而调控线粒体生成的重要作用。近年来,mtSSB... 

【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校

【文章页数】：108 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
缩略语表
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前言
文献回顾
第一部分 mtSSB在结直肠癌中的表达及其临床意义
    1 材料
        1.1 研究对象
        1.2 主要试剂和耗材
        1.3 主要仪器
    2 方法
        2.1 提取样本组织总RNA和反转录
        2.2 实时定量PCR反应实验
        2.3 组织蛋白质的提取
        2.4 BCA蛋白定量
        2.5 Western blot实验检测结直肠癌组织mtSSB表达
        2.6 免疫组织化学染色实验
        2.7 统计分析
    3 结果
        3.1 结直肠癌组织样本分析mtSSB的表达差异
        3.2 mtSSB表达高低与结直肠癌患者预后的相关性分析
    4 讨论
第二部分 mtSSB调控结直肠癌细胞生长的生物学作用研究
    1 材料
        1.1 研究对象
        1.2 主要试剂和耗材
        1.3 主要仪器
    2 方法
        2.1 细胞培养
        2.2 mtSSB过表达质粒载体构建
        2.3 shRNA干涉质粒构建
        2.4 CRC细胞转染
        2.5 稳转细胞筛选
        2.6 检测mtSSB过表达和干涉效果
        2.7 细胞计数方法检测细胞数目
        2.8 EDU检测细胞增殖
        2.9 克隆形成的检测
        2.10 Western blot实验
        2.11 裸鼠皮下成瘤实验
        2.12 HE染色
        2.13 IHC染色
        2.14 统计学分析
    3 结果
        3.1 mtSSB在不同结直肠癌细胞系中表达情况
        3.2 检测mtSSB在结直肠癌细胞中的过表达和干涉效果
        3.3 体外实验检测mtSSB对结直肠癌细胞增殖的影响
        3.4 体内实验检测mtSSB对结直肠癌细胞增殖的影响
    4 讨论
第三部分 mtSSB调控结直肠癌细胞生长的机制研究
    1 材料
        1.1 研究对象
        1.2 主要试剂和耗材
        1.3 主要仪器
    2 方法
        2.1 提取基因组DNA
        2.2 实时定量PCR检测mtDNA拷贝数
        2.3 透射电镜观察并统计线粒体数目
        2.4 线粒体氧耗实验
        2.5 ATP生成实验
        2.6 端粒酶活性检测
        2.7 实时定量PCR检测端粒长度
        2.8 ROS含量检测
    3 结果
        3.1 mtSSB对结直肠癌细胞中mtDNA拷贝数的影响
        3.2 mtSSB对结直肠癌细胞中线粒体数目的影响
        3.3 结直肠癌临床样本中检测mtSSB对线粒体数目和mtDNA拷贝数的影响
        3.4 mtSSB对结直肠癌细胞线粒体氧化磷酸化功能的影响
        3.5 mtSSB对结直肠癌细胞线粒体ATP生成的影响
        3.6 mtSSB对结直肠癌细胞端粒酶活性的影响
        3.7 mtSSB对结直肠癌细胞端粒长度的影响
        3.8 mtSSB对结直肠癌细胞ROS水平的影响
        3.10 mtSSB干涉后加H2O2对结直肠癌细胞端粒酶活性和端粒长度影响
    4 讨论
第四部分 调控结直肠癌细胞mtSSB表达的机制研究
    1 材料
        1.1 研究对象
        1.2 主要试剂和耗材
        1.3 主要仪器
    2 方法
        2.1 炎症因子刺激结直肠癌细胞
        2.2 Westernblot实验
        2.3 IHC实验
        2.4 构建mtSSB基因5’上游启动子区截短体荧光素酶报告质粒
        2.5 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验
        2.5 转染细胞
        2.6 细胞计数实验
        2.7 EDU细胞增殖实验
        2.8 平板克隆实验
    3 结果
        3.1 不同浓度的细胞因子对mtSSB表达的影响
        3.2 FOXP1直接转录调控mtSSB的表达
        3.3 IL-6通过mtSSB调控CRC细胞的生长
        3.4 裸鼠皮下成瘤体内实验验证IL-6通过mtSSB调控结直肠癌细胞的生长·
    4 讨论
小结
参考文献
个人简历和研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]中国结直肠癌发病趋势分析和预测[J]. 代珍,郑荣寿,邹小农,张思维,曾红梅,李霓,陈万青.  中华预防医学杂志. 2012 (07)
[2]Telomere function in colorectal cancer[J]. Cristina Frías,Alberto Morán,Carmen de Juan,Paloma Ortega,Tamara Fernández-Marcelo,Andrés Sánchez-Pernaute,Antonio José Torres,Eduardo Díaz-Rubio,Manuel Benito,Pilar Iniesta.  World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2009(01)



本文编号：3194142