稳定沉默ROR1调控肺腺癌细胞周期、凋亡和自噬的分子机制

发布时间：2021-05-23 23:47

　　目的利用慢病毒载体介导的shRNA-ROR1（Lv-shROR1）建立稳定沉默ROR1的肺腺癌细胞株,并利用该细胞模型初步研究ROR1调控肿瘤细胞周期、凋亡和自噬的分子机制,为后续以ROR1为治疗靶点的研究奠定基础。方法首先,使用带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的慢病毒介导shRNA-ROR1感染肺腺癌PC9、PC9erlo和NCI-H1975细胞株,利用荧光显微镜检测感染细胞中GFP的荧光信号来衡量慢病毒感染细胞的情况,并采用流式细胞术检测Lv-shROR1沉默ROR1蛋白的效率;其次,利用有限稀释法从Lv-shROR1感染的肺腺癌细胞株中挑选单细胞克隆,进一步利用免疫印迹法、流式细胞术和RT-PCR检测克隆细胞株ROR1蛋白和mRNA表达水平进而筛选出一系列稳定沉默ROR1的单细胞克隆,作为后续功能研究的细胞模型;最后,选取PC9erlo单细胞克隆R1进行后续研究,分别利用免疫印迹法检测该细胞株中沉默ROR1后细胞周期和凋亡分子水平的变化;利用Ray Bio?C-series Human Autophagy Array 1和免疫印迹法检测ROR1基因沉默前后自噬分子水平的变化;利用H... 

【文章来源】：成都中医药大学四川省

【文章页数】：89 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
缩略词表
引言
第一部分 构建并鉴定稳定沉默ROR1的肺腺癌细胞株
    (一)构建稳定沉默ROR1的肺腺癌细胞株
        1 实验材料
            1.1 细胞株
            1.2 实验试剂
            1.3 实验设备
        2 实验方法
            2.1 细胞培养
                2.1.1 相关实验试剂的配制方法
                2.1.2 细胞复苏
                2.1.3 细胞传代与细胞换液
                2.1.4 细胞冻存
                2.1.5 废液处理
            2.2 慢病毒介导shRNA-ROR1 感染肺腺癌细胞株
                2.2.1 细胞接种
                2.2.2 使用不同感染复数(MOI)值的慢病毒感染肺腺癌细胞株
                2.2.3 荧光显微镜检测慢病毒感染效率
                2.2.4 筛选稳定转染的细胞株
            2.3 流式细胞术检测Lv-shROR1 对肺腺癌细胞株膜蛋白ROR1 的沉默效率
                2.3.1 细胞接种
                2.3.2 流式细胞术检测Lv-shROR1 对肺腺癌细胞株细胞膜ROR1 蛋白的沉默效率
                2.3.3 计算Lv-shROR1 对肺腺癌细胞株细胞膜ROR1 蛋白的沉默效率
        3 实验结果
        4 讨论与小结
            4.1 讨论
            4.2 小结
    (二)筛选并鉴定稳定沉默ROR1的肺腺癌单细胞克隆
        1 实验材料
            1.1 细胞株
            1.2 实验试剂
            1.3 实验设备
        2 实验方法
            2.1 细胞培养
                2.1.1 相关实验试剂的配制方法
                2.1.2 细胞复苏
                2.1.3 细胞传代及细胞换液
                2.1.4 细胞冻存
            2.2 有限稀释法筛选单细胞克隆
            2.3 利用免疫印迹法检测Lv-shROR1 沉默单细胞克隆ROR1 总蛋白的水平
                2.3.1 细胞接种
                2.3.2 样品蛋白的提取与定量
                2.3.3 免疫印迹法检测Lv-shROR1 沉默单细胞克隆ROR1 总蛋白的水平
                2.3.4 数据分析方法
            2.4 利用流式细胞术检测Lv-shROR1 抑制膜蛋白ROR1 的表达水平
                2.4.1 细胞接种
                2.4.2 流式细胞术检测Lv-shROR1 抑制膜蛋白ROR1 的表达水平
                2.4.3 计算Lv-shROR1 抑制膜蛋白ROR1后ROR1 的表达效率
            2.5 利用RT-PCR检测Lv-shROR1 沉默ROR1 m RNA的水平
                2.5.1 细胞接种
                2.5.2 RT-PCR检测Lv-shROR1 沉默ROR1 m RNA的水平
                2.5.3 数据统计分析方法
        3 实验结果
        4 讨论与小结
            4.1 讨论
            4.2 小结
第二部分 受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)调控肺腺癌细胞周期、凋亡和自噬的分子机制
    (一)ROR1调控肺腺癌细胞周期的分子机制
        1 实验材料
            1.1 细胞株
            1.2 实验试剂
            1.3 实验设备
        2 实验方法
            2.1 细胞培养
                2.1.1 相关实验试剂的配制方法
                2.1.2 细胞复苏
                2.1.3 细胞传代及细胞换液
                2.1.4 细胞冻存
            2.2 利用免疫印迹法检测Lv-shROR1 沉默ROR1 细胞周期分子水平的变化
                2.2.1 细胞接种
                2.2.2 样品蛋白的提取与定量
                2.2.3 免疫印迹法检测ROR1 调控肺腺癌细胞周期分子CDK4和Cyclin E1 的表达
            2.3 数据统计分析方法
        3 实验结果
        4 讨论与小结
            4.1 讨论
            4.2 小结
    (二)ROR1调控肺腺癌细胞凋亡的分子机制
        1 实验材料
            1.1 细胞株
            1.2 实验试剂
            1.3 实验设备
        2 实验方法
            2.1 细胞培养
                2.1.1 相关实验试剂的配制方法
                2.1.2 细胞复苏
                2.1.3 细胞传代及细胞换液
                2.1.4 细胞冻存
            2.2 利用免疫印迹法检测Lv-shROR1 沉默ROR1 细胞凋亡分子水平的变化
                2.2.1 细胞接种
                2.2.2 样品蛋白的提取与定量
                2.2.3 免疫印迹法检测ROR1 调控肺腺癌细胞凋亡分子Caspase-3、Caspase-7、Bak、Bcl-XL和 Bcl-2 的表达
            2.3 数据统计分析方法
        3 实验结果
        4 讨论与小结
            4.1 讨论
            4.2 小结
    (三)ROR1调控肺腺癌细胞自噬的分子机制
        1 实验材料
            1.1 细胞株
            1.2 实验试剂
            1.3 实验设备
        2 实验方法
            2.1 细胞培养
                2.1.1 相关实验试剂的配制方法
                2.1.2 细胞复苏
                2.1.3 细胞传代及细胞换液
                2.1.4 细胞冻存
            2.2 利用Ray Bio?C-series Human Autopahgy Array1 检测ROR1 基因沉默前后肺腺癌细胞株中自噬分子水平的变化
                2.2.1 细胞接种
                2.2.2 样品蛋白的提取与定量
                2.2.3 利用Ray Bio?C-series Human Autopahgy Array1 检测ROR1 基因沉默前后肺腺癌细胞株中自噬分子水平的变化
                2.2.4 数据分析方法
            2.3 利用免疫印迹法进一步证明ROR1 基因沉默前后肺腺癌细胞株中LC3 A/B分子水平的变化
                2.3.1 细胞接种
                2.3.2 样品蛋白的提取与定量
                2.3.3 利用免疫印迹法进一步证明ROR1 基因沉默前后肺腺癌细胞株中LC3 A/B分子水平的变化
                2.3.4 数据统计分析方法
        3 实验结果
        4 讨论与小结
            4.1 讨论
            4.2 小结
    (四)ROR1 介导的Akt/GSK-3α/β/m TOR信号通路在肺腺癌中发挥重要的致病作用
        1 实验材料
            1.1 细胞株
            1.2 实验试剂
            1.3 实验设备
        2 实验方法
            2.1 细胞培养
                2.1.1 相关实验试剂的配制方法
                2.1.2 细胞复苏
                2.1.3 细胞传代及细胞换液
                2.1.4 细胞冻存
            2.2 利用Human Phosphor-kinase Array kit检测ROR1 基因沉默前后肺腺癌细胞株中关键激酶磷酸化水平变化
                2.2.1 细胞接种
                2.2.2 样品蛋白的提取与定量
                2.2.3 利用Human Phospho-kinase Array kit筛选ROR1 基因沉默前后肺腺癌细胞株中关键激酶磷酸化水平变化
                2.2.4 数据统计分析方法
            2.3 利用免疫印迹法进一步证明ROR1 介导的Akt/GSK-3α/β/m TOR信号通路在肺腺癌中发挥重要致病作用
                2.3.1 细胞接种
                2.3.2 样品蛋白的提取与定量
                2.3.3 免疫印迹法检测ROR1 调控肺腺癌细胞信号通路分子Akt、P-Akt、GSK-3α/β、m TOR和 P-m TOR的表达
                2.3.4 数据统计分析方法
            2.4 预实验:利用免疫印迹法检测ROR1 调控肺腺癌细胞Akt下游关键糖酵解相关分子HIF-1α分子的表达
        3 实验结果
        4 讨论与小结
            4.1 讨论
            4.2 小结
总结与展望
文献综述 探讨肺癌新靶标ROR1的作用机制及其临床运用
致谢
参考文献
附录
    附录1 在读期间公开发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]Progress in image-guided radiotherapy for the treatment of non-small cell lung cancer[J]. Xiao-Cang Ren,Yue-E Liu,Jing Li,Qiang Lin.  World Journal of Radiology. 2019(03)
[2]ROR1对人肺癌A549细胞上皮-间质转化的影响[J]. 王作刚,冯彦,于亮,赵子梁,倪建林,邹俊卿,黄洋.  肿瘤防治研究. 2018(07)
[3]ROR1激活AKT/FOXO1信号介导非小细胞肺癌吉非替尼耐药[J]. 黄洋,冯彦,于亮,赵子梁,邹俊卿,倪建林,王作刚.  中国生物化学与分子生物学报. 2018(02)
[4]受体酪氨酸激酶样孤儿受体在肿瘤免疫治疗中的研究进展[J]. 王凌菲,王皓.  现代免疫学. 2015(02)



本文编号：3203183