SIRT5通过去琥珀酰化SHMT2促进肿瘤细胞增殖
发布时间：2021-06-16 03:24
一碳代谢通路中多种代谢酶与肿瘤的发生、发展都有密切关系,它们都可以作为肿瘤治疗的潜在靶点.丝氨酸羟甲基转移酶2（SHMT2）作为其中的关键代谢酶之一,对于肿瘤细胞的生长增殖具有非常重要的意义.然而SHMT2参与调解肿瘤细胞代谢的具体作用机制目前尚不明确.本研究发现SIRT5能去琥珀酰化SHMT2,提升其酶活,并鉴定到第181位赖氨酸是SHMT2的主要琥珀酰化位点.同时,本文还发现高浓度的甲氨蝶呤（MTX）能通过抑制SIRT5的表达,提升SHMT2琥珀酰化水平,达到抑制肿瘤细胞增殖的目的,这也为通过抑制SIRT5阻断肿瘤生长提供了新的理论支撑.
【文章来源】：复旦学报(自然科学版). 2020,59(01)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
SHMT2和SIRT5相互作用
由于SIRT5是去酰化修饰酶，具备去琥珀酰化，去丙二酰化和去戊二酰化活性，且这些蛋白翻译后修饰的过程是可逆的，烟酰胺（Nicotinamide,NAM）作为SIRT5去酰化修饰产物，能够反馈抑制去酰化修饰的发生，故使用NAM处理细胞，以确定SHMT2能够被酰化修饰．通过包装慢病毒感染HEK293T细胞，我们构建了表达Flag-SHMT2的稳定细胞系．用500μmol/L NAM处理该稳定株后发现，在8h内，随着时间的增加，SHMT2琥珀酰化水平不断提高，而丙二酰化和戊二酰化却无明显变化趋势（图2(a））．因此，确定SHMT2能够被琥珀酰化修饰．继而，我们将Flag-SHMT2和HA-SIRT5共转于HEK293T细胞中，经Western blot验证，SIRT5能去琥珀酰化SHMT2蛋白（图2(c））．同时，为了验证SHMT2蛋白的琥珀酰化对其酶活的影响，我们使用DL-β-苯基丝氨酸作为SHMT2酶活反应底物检测其酶活，发现NAM处理会降低SHMT2酶活性，而SIRT5则能显著提升其酶活性（图2(b,d））．这证明了SHMT2的琥珀酰化修饰会抑制本身的催化活性．
首先，为进一步确认SHMT2蛋白的主要琥珀酰化位点，我们将这些位点上的赖氨酸K分别突变为谷氨酸E（模拟琥珀酰化修饰）和精氨酸R（模拟去琥珀酰化修饰），并检测相应突变蛋白的琥珀酰化修饰水平和酶活．实验表明：与野生型SHMT2蛋白相比，K181E突变蛋白的琥珀酰化水平及酶活均显著降低（图3(b））．虽然K269E,K302E,K469E等3个位点的琥珀酰化修饰均有所下调，但其相应酶活却显著升高（图3(b）），所以，综上，我们初步确定K181位点是SHMT2蛋白的主要琥珀酰化位点．其次通过实验发现，与野生型相比，SHMT2突变蛋白K181E及K181R的酶活在体外显著性降低（图3(c））．同时，在测定酶活的反应液中分别加入HA-SIRT5或NAM，我们发现野生型的SHMT2蛋白酶活会分别显著性地提升及降低，而K181E和K181R两个突变蛋白的酶活却基本没有发生改变（图3(c）），表明SHMT2的181位点突变之后，其酶活不再受SIRT5和NAM影响，进一步证明第181位赖氨酸是SHMT2的主要琥珀酰化修饰位点．值得注意的是，在加入SIRT5之后K181R酶活显著降低（图3(c）），这可能是SHMT2存在其他位点受SIRT5调控．K181E突变体酶活较低（～0.2），故过表达SIRT5之后酶活无进一步的明显变化；而K181R酶活较高（～0.5），故对K181R的影响较大．
【参考文献】：
期刊论文
[1]SIRT5, functions in cellular metabolism with a multiple enzymatic activities[J]. YANG Xin,LIU BoYa,ZHU WeiGuo,LUO JianYuan. Science China（Life Sciences）. 2015(09)
本文编号：3232260
【文章来源】：复旦学报(自然科学版). 2020,59(01)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
SHMT2和SIRT5相互作用
由于SIRT5是去酰化修饰酶，具备去琥珀酰化，去丙二酰化和去戊二酰化活性，且这些蛋白翻译后修饰的过程是可逆的，烟酰胺（Nicotinamide,NAM）作为SIRT5去酰化修饰产物，能够反馈抑制去酰化修饰的发生，故使用NAM处理细胞，以确定SHMT2能够被酰化修饰．通过包装慢病毒感染HEK293T细胞，我们构建了表达Flag-SHMT2的稳定细胞系．用500μmol/L NAM处理该稳定株后发现，在8h内，随着时间的增加，SHMT2琥珀酰化水平不断提高，而丙二酰化和戊二酰化却无明显变化趋势（图2(a））．因此，确定SHMT2能够被琥珀酰化修饰．继而，我们将Flag-SHMT2和HA-SIRT5共转于HEK293T细胞中，经Western blot验证，SIRT5能去琥珀酰化SHMT2蛋白（图2(c））．同时，为了验证SHMT2蛋白的琥珀酰化对其酶活的影响，我们使用DL-β-苯基丝氨酸作为SHMT2酶活反应底物检测其酶活，发现NAM处理会降低SHMT2酶活性，而SIRT5则能显著提升其酶活性（图2(b,d））．这证明了SHMT2的琥珀酰化修饰会抑制本身的催化活性．
首先，为进一步确认SHMT2蛋白的主要琥珀酰化位点，我们将这些位点上的赖氨酸K分别突变为谷氨酸E（模拟琥珀酰化修饰）和精氨酸R（模拟去琥珀酰化修饰），并检测相应突变蛋白的琥珀酰化修饰水平和酶活．实验表明：与野生型SHMT2蛋白相比，K181E突变蛋白的琥珀酰化水平及酶活均显著降低（图3(b））．虽然K269E,K302E,K469E等3个位点的琥珀酰化修饰均有所下调，但其相应酶活却显著升高（图3(b）），所以，综上，我们初步确定K181位点是SHMT2蛋白的主要琥珀酰化位点．其次通过实验发现，与野生型相比，SHMT2突变蛋白K181E及K181R的酶活在体外显著性降低（图3(c））．同时，在测定酶活的反应液中分别加入HA-SIRT5或NAM，我们发现野生型的SHMT2蛋白酶活会分别显著性地提升及降低，而K181E和K181R两个突变蛋白的酶活却基本没有发生改变（图3(c）），表明SHMT2的181位点突变之后，其酶活不再受SIRT5和NAM影响，进一步证明第181位赖氨酸是SHMT2的主要琥珀酰化修饰位点．值得注意的是，在加入SIRT5之后K181R酶活显著降低（图3(c）），这可能是SHMT2存在其他位点受SIRT5调控．K181E突变体酶活较低（～0.2），故过表达SIRT5之后酶活无进一步的明显变化；而K181R酶活较高（～0.5），故对K181R的影响较大．
【参考文献】：
期刊论文
[1]SIRT5, functions in cellular metabolism with a multiple enzymatic activities[J]. YANG Xin,LIU BoYa,ZHU WeiGuo,LUO JianYuan. Science China（Life Sciences）. 2015(09)
本文编号：3232260
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/3232260.html
