MicroRNA-100在宫颈癌中下调并通过靶向Shp2抑制细胞增殖、迁移和侵袭
发布时间：2021-06-18 19:04
目的:探讨miRNA-100在宫颈癌中的表达情况,以及改变其表达水平是否可以影响宫颈癌细胞的恶性生物学行为。方法:1.采用qRT-PCR检测细胞系（宫颈癌细胞HeLa,SiHa和人永生化角质形成细胞HaCaT）以及21例未经治疗的宫颈癌临床病例标本（癌组织和邻近正常组织）中的miRNA-100的表达情况。2.采用Western blotting检测宫颈癌组织和邻近正常组织中Shp2蛋白的含量。3.在宫颈癌细胞中感染慢病毒载体,建立敲低miRNA-100表达的Hela细胞株和抬高miRNA-100表达的SiHa细胞株。4.利用构建好的稳转细胞株来研究miRNA-100的生物学功能。（1）流式细胞术检测HeLa和SiHa细胞中Ki67蛋白的阳性率（Ki67蛋白的表达水平可反应肿瘤细胞的恶性增殖能力）;（2）平板克隆实验检测HeLa和SiHa细胞的克隆形成能力;（3）Transwell实验检测HeLa和SiHa细胞的迁移和侵袭能力;5.利用Western blotting检测Shp2蛋白表达水平的改变及下游信号通路中p-ERK和p-AKT的改变。结果:1.与人永生化角质形成细胞HaCaT相比...
【文章来源】：安徽医科大学安徽省
【文章页数】：54 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
qRT-PCR检测miRNA-100在宫颈癌组织和细胞中的表达情况
安徽医科大学硕士学位论文29图2Westernblotting检测宫颈癌组织和细胞中Shp2的表达情况。A：Shp2在宫颈癌组织中表达上升；B：Shp2在宫颈癌细胞中表达上升。*P<0.05，***P<0.001。Fig2WesternblottingwasusedtodetecttheexpressionofShp2incervicalcancertissuesandcells.A:Shp2expressionincreasesincervicalcancertissues;B:Shp2expressionisincreasedincervicalcancercells.*P<0.05,***P<0.001.3.3敲低或过表达miRNA-100的宫颈癌细胞株的建立前期实验中通过qRT-PCR检测结果可知，HeLa细胞中的miRNA-100表达高于SiHa细胞株。因此，在HeLa细胞中转染敲低miRNA-100的慢病毒载体，而在SiHa细胞株中转染过表达miRNA-100的慢病毒载体。具体即是将hsa-miRNA-100-5pinhibitor及阴性对照感染HeLa细胞株，将hsa-miRNA-100-5pmimic及阴性对照感染SiHa细胞株，然后用嘌呤霉素筛选出稳定表达的细胞株，直至用倒置显微镜可以观察到所有的细胞均能够表达GFP荧光（如图3A）。由于本实验中的慢病毒无法直接通过qRT-PCR的方法检测其转染效率，因此我们采用Westernblotting检测了miRNA-100的直接靶蛋白mTOR的表达水平，以验证慢病毒的转染结果。通过Westernblotting的检测发现转染miRNA-100-5pinhibitor的HeLa细胞株，mTOR蛋白的表达水平高于未处理组和阴性对照组（如图3B）；
安徽医科大学硕士学位论文30而转染了miRNA-100-5pmimic的SiHa细胞株，mTOR蛋白的表达水平低于未处理组和阴性对照组（如图3B）。上述结果表明，通过慢病毒转染的方式，我们构建了稳定敲低miRNA-100-5p表达的HeLa细胞株和稳定过表达miRNA-100-5p的SiHa细胞株。图3A：HeLa和SiHa细胞稳定表达GFP荧光蛋白。B：Westernblotting检测miRNA-100直接靶蛋白mTOR的表达情况：在HeLa细胞中下调miRNA-100表达后，mTOR表达水平上升；在SiHa细胞中过表达miRNA-100后，mTOR表达水平下降。Figure3A:HeLaandSiHacellsstablyexpressGFPfluorescentprotein.B:WesternblottingwasusedtodetecttheexpressionofmTOR-100:afterdown-regulatingmiRNA-100expressioninHeLacells,mTORexpressionlevelsincreased;aftermiRNA-100overexpressioninSiHacells,mTORexpressionlevelsdecreased.3.4miRNA-100对宫颈癌细胞增殖能力的影响Ki67蛋白的表达水平可反应肿瘤细胞的恶性增殖能力，其阳性率越高代表肿瘤的增殖能力越强。取对数生长期的HeLa细胞分为三组，即未处理组（Control）、阴性对照组（miRNA-100NC）和抑制组（inhibitor）；同样，SiHa细胞也分为三
【参考文献】：
期刊论文
[1]免疫调节细胞FoxP3+Treg及免疫蛋白PD-L1在宫颈病变微环境中的表达[J]. 马茜,赵敏伊,魏星,赵娟,杨婷,张倩,王凯,杨筱凤. 中国医学科学院学报. 2017(01)
[2]我国宫颈癌流行病学特征和高危因素分析[J]. 刘慧强. 中国妇幼保健. 2016(06)
[3]hsa-miR-100的生物信息学分析[J]. 付海龙,徐广峰,史春梅,季晨博,郭锡熔,赵亚萍. 国际检验医学杂志. 2012(18)
本文编号：3237217
【文章来源】：安徽医科大学安徽省
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
qRT-PCR检测miRNA-100在宫颈癌组织和细胞中的表达情况
安徽医科大学硕士学位论文29图2Westernblotting检测宫颈癌组织和细胞中Shp2的表达情况。A：Shp2在宫颈癌组织中表达上升；B：Shp2在宫颈癌细胞中表达上升。*P<0.05，***P<0.001。Fig2WesternblottingwasusedtodetecttheexpressionofShp2incervicalcancertissuesandcells.A:Shp2expressionincreasesincervicalcancertissues;B:Shp2expressionisincreasedincervicalcancercells.*P<0.05,***P<0.001.3.3敲低或过表达miRNA-100的宫颈癌细胞株的建立前期实验中通过qRT-PCR检测结果可知，HeLa细胞中的miRNA-100表达高于SiHa细胞株。因此，在HeLa细胞中转染敲低miRNA-100的慢病毒载体，而在SiHa细胞株中转染过表达miRNA-100的慢病毒载体。具体即是将hsa-miRNA-100-5pinhibitor及阴性对照感染HeLa细胞株，将hsa-miRNA-100-5pmimic及阴性对照感染SiHa细胞株，然后用嘌呤霉素筛选出稳定表达的细胞株，直至用倒置显微镜可以观察到所有的细胞均能够表达GFP荧光（如图3A）。由于本实验中的慢病毒无法直接通过qRT-PCR的方法检测其转染效率，因此我们采用Westernblotting检测了miRNA-100的直接靶蛋白mTOR的表达水平，以验证慢病毒的转染结果。通过Westernblotting的检测发现转染miRNA-100-5pinhibitor的HeLa细胞株，mTOR蛋白的表达水平高于未处理组和阴性对照组（如图3B）；
安徽医科大学硕士学位论文30而转染了miRNA-100-5pmimic的SiHa细胞株，mTOR蛋白的表达水平低于未处理组和阴性对照组（如图3B）。上述结果表明，通过慢病毒转染的方式，我们构建了稳定敲低miRNA-100-5p表达的HeLa细胞株和稳定过表达miRNA-100-5p的SiHa细胞株。图3A：HeLa和SiHa细胞稳定表达GFP荧光蛋白。B：Westernblotting检测miRNA-100直接靶蛋白mTOR的表达情况：在HeLa细胞中下调miRNA-100表达后，mTOR表达水平上升；在SiHa细胞中过表达miRNA-100后，mTOR表达水平下降。Figure3A:HeLaandSiHacellsstablyexpressGFPfluorescentprotein.B:WesternblottingwasusedtodetecttheexpressionofmTOR-100:afterdown-regulatingmiRNA-100expressioninHeLacells,mTORexpressionlevelsincreased;aftermiRNA-100overexpressioninSiHacells,mTORexpressionlevelsdecreased.3.4miRNA-100对宫颈癌细胞增殖能力的影响Ki67蛋白的表达水平可反应肿瘤细胞的恶性增殖能力，其阳性率越高代表肿瘤的增殖能力越强。取对数生长期的HeLa细胞分为三组，即未处理组（Control）、阴性对照组（miRNA-100NC）和抑制组（inhibitor）；同样，SiHa细胞也分为三
【参考文献】：
期刊论文
[1]免疫调节细胞FoxP3+Treg及免疫蛋白PD-L1在宫颈病变微环境中的表达[J]. 马茜,赵敏伊,魏星,赵娟,杨婷,张倩,王凯,杨筱凤. 中国医学科学院学报. 2017(01)
[2]我国宫颈癌流行病学特征和高危因素分析[J]. 刘慧强. 中国妇幼保健. 2016(06)
[3]hsa-miR-100的生物信息学分析[J]. 付海龙,徐广峰,史春梅,季晨博,郭锡熔,赵亚萍. 国际检验医学杂志. 2012(18)
本文编号：3237217
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