着丝粒蛋白-U（CENP-U）在三阴性乳腺癌血管生成中的作用研究
发布时间：2021-06-29 03:06
研究目的1.通过二代测序技术筛选三阴性乳腺癌细胞系中CENP-U差异表达相关基因和血管生成相关基因。2.通过体外实验,在MDA-MB-231和CAL51中建立CENP-U稳定表达细胞系,分析CENP-U基因在不同细胞系中的表达情况及对血管形成的作用。3.通过体内实验,分析小鼠乳腺癌模型中CENP-U基因与血管生成因子的相关性及对血管形成的影响。研究方法1.运用二代测序技术分析基因功能;分析基因与疾病的关系;分析基因组、化学和系统功能信息;分析人类各项反应及生物学通路。测序分析:提取总RNA,然后m RNA富集,双连c DNA合成,之后末端修复,加A和接头,选出预测片段后,进行PCR扩增,并建立文库,后二代测序仪测序。2.采用实时定量PCR方法检测不同细胞系中CENP-U在m RNA水平表达情况,通过Western blotting检测不同细胞系中的CENP-U在蛋白水平表达情况。3.通过转染质粒,在MDA-MB-231和CAL51中构建稳定表达CENP-U细胞稳系,设置对照组（vector组）和降表达组（sh CENP-U组）。采用MTT比色法和平板克隆实验检测细胞稳系中不同组间细胞的...
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
基因测序流程图
天津医科大学博士学位论文 一、CENP-U 在三阴性乳腺癌细胞系的二代测序分析研见测序接头注释），AMPure XP beads 筛选大小为 200bp 左右的 cDNA，PCR 增，AMPure XP beads 再次纯化 PCR 产物，最终获得理想的文库。其原理如图 2 左所示。链特异性建库：第一条链方法与 NEB 普通建库方法相同，关键在于合成二条链时有不同之处：dNTPs 中的 dTTP 由 dUTP 取代，之后同样进行 cDNA 端修复、加 A 尾、连接测序接头和长度筛选，然后先使用 USER 酶降解含 U cDNA 第二链再进行 PCR 扩增并获得文库。链特异性文库的优点很多，例如相同条件下，可以获取更多、更为有效的数据信息；能获得更准确的基因定位定量与基因注释信息等等。其原理如下图 2 右所示。
.3 上机测序文库检验合格后，把不同的文库按有效浓度、目标下机数据量的需求 po上机行 Illumina HiSeq 测序。测序的基本原理：一边合成，同时测equencing by Synthesis)。工作原理：在测序的 flow cell 中加入不同荧光dNTP、DNA 聚合酶和接头引物，同时扩增，当每一个测序簇延伸至互被荧光标记的 dNTP 就能释放出一对一的荧光信号，这些荧光信号可以准确捕获，同步的计算机软件会将光信号转化为测序的峰值，最后得到的序列信息。.4 信息分析流程RNA-seq 的核心程序是基因表达差异的显著性分析[23]，有多种比对方统计学方法，比较两种或更多种条件下的基因表达差异，以鉴定与条件定基因，并进一步分析这些特定基因表达异常位点的生物学意义。分析许多方面：质量控制，定量，比对，差异显着性分析和功能富集分析，录本预测，变异位点，融合基因分析和可变剪接。如下图 3 所示。
本文编号：3255595
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
基因测序流程图
天津医科大学博士学位论文 一、CENP-U 在三阴性乳腺癌细胞系的二代测序分析研见测序接头注释），AMPure XP beads 筛选大小为 200bp 左右的 cDNA，PCR 增，AMPure XP beads 再次纯化 PCR 产物，最终获得理想的文库。其原理如图 2 左所示。链特异性建库：第一条链方法与 NEB 普通建库方法相同，关键在于合成二条链时有不同之处：dNTPs 中的 dTTP 由 dUTP 取代，之后同样进行 cDNA 端修复、加 A 尾、连接测序接头和长度筛选，然后先使用 USER 酶降解含 U cDNA 第二链再进行 PCR 扩增并获得文库。链特异性文库的优点很多，例如相同条件下，可以获取更多、更为有效的数据信息；能获得更准确的基因定位定量与基因注释信息等等。其原理如下图 2 右所示。
.3 上机测序文库检验合格后，把不同的文库按有效浓度、目标下机数据量的需求 po上机行 Illumina HiSeq 测序。测序的基本原理：一边合成，同时测equencing by Synthesis)。工作原理：在测序的 flow cell 中加入不同荧光dNTP、DNA 聚合酶和接头引物，同时扩增，当每一个测序簇延伸至互被荧光标记的 dNTP 就能释放出一对一的荧光信号，这些荧光信号可以准确捕获，同步的计算机软件会将光信号转化为测序的峰值，最后得到的序列信息。.4 信息分析流程RNA-seq 的核心程序是基因表达差异的显著性分析[23]，有多种比对方统计学方法，比较两种或更多种条件下的基因表达差异，以鉴定与条件定基因，并进一步分析这些特定基因表达异常位点的生物学意义。分析许多方面：质量控制，定量，比对，差异显着性分析和功能富集分析，录本预测，变异位点，融合基因分析和可变剪接。如下图 3 所示。
本文编号：3255595
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