KCTD11通过与β-catenin结合调节Wnt通路和Hippo通路活性-抑制肺癌细胞的增殖和转移
发布时间：2021-07-04 00:53
背景:目前已经报道了KCTD11在几种肿瘤类型中是潜在的肿瘤抑制剂。然而,尚未在人类非小细胞肺癌（NSCLC）中报道KCTD11的表达及其作用。其潜在的分子机制是否与其具有Cullin介导的活性的KCTD11 BTB结构域相关尚不清楚。研究方法:利用免疫组化检测139例NSCLC患者组织样本KCTD11的表达情况并分析其与诸多临床病理因素的相关性。在体内外验证KCTD11对肺癌细胞生物学行为的影响。采用Western blot、双荧光素酶报告基因、RT-qpcr、免疫荧光和核浆蛋白质分离观测Wnt通路和Hippo通路的活性变化及对EMT过程的作用。免疫沉淀、共转染和构建剪切体KCTD11-ΔBTB验证KCTD11对Wnt/β-catenin与Hippo/YAP的潜在作用及KCTD11自身作用位点。结果:在本研究中,我们发现KCTD11在肺癌组织和细胞中低表达,并且与分化程度,肿瘤淋巴结转移（TNM）分期和淋巴结转移呈负相关。KCTD11的低表达与预后不良有关。KCTD11的过表达抑制了肺癌细胞的增殖和迁移,在敲除后结果相反。进一步的研究表明,KCTD11通过抑制β-catenin和YA...
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
KCTD11抑制NSCLC的增殖和侵袭A-C：在过表达KCTD11的A549细胞中，集落形成测定，Transwell测定和MTT测定显示细胞的增殖和侵袭能力减小
14中国医科大学硕士学位论文补充图S1KCTD11抑制NSCLC细胞的恶性行为A–C：在过表达KCTD11的H460细胞中，集落形成测定，Transwell测定和MTT测定显示细胞的增殖和侵袭减少。D-F：而集落形成测定，Transwell测定和MTT测定表明，在缺失KCTD11的HBE细胞中，细胞的增殖和侵袭增加。G：在裸鼠中过表达KCTD11并饲养6周后未进行解剖的裸鼠的照片。H：与对照组（n=7）相比，向裸鼠（n=7）的尾静脉注射稳定表达KCTD11的A549细胞（G418筛查）减少了肺转移的病灶数。缩写：EV，空向量；NC，负控制。3.3KCTD11通过上调NSCLC细胞中YAP的磷酸化水平激活了Hippo通路通过双重荧光素酶测定，转染KCTD11上调了Hippo信号通路的活性，而敲除KCTD11抑制了Hippo信号通路的活性（图3A-B）。然后，研究发现在KCTD11过表达的A549细胞中，与Hippo信号通路相关的靶基因CTGF，CYR61和cyclinEmRNA被下调，而在KCTD11敲除的H1299细胞中被上调（图3C-D），表明KCTD11参与Hippo信号通路。因此，我们很好奇KCTD11在Hippo通路信号转导过程中是否参与调节YAP/P-YAP的表达。在过表达KCTD11的A549细胞和H460细胞系以及缺乏内源性KCTD11的H1299和HBE细胞系中，YAP，LATS1均未见明显变化，但研究发现P-YAP被KCTD11明显上调。当研究中敲除内源性KCTD11时，我们观察到在H1299细胞和HBE细胞中P-YAP被下调。与增殖相关的基因CyclinE和CTGF在KCTD11过表达的细胞系被下调，而在缺乏
15中国医科大学硕士学位论文内源性KCTD11表达的细胞系被上调（图3E-F）。通过细胞核-细胞质蛋白分离和免疫荧光，我们还发现YAP的核转位在转染KCTD11的A549细胞系中受到抑制。图3G，I）。在H1299细胞系中结果相反，KCTD11的敲除促进了YAP的核易位（图3H，J）。因此，这些结果表明KCTD11通过促进YAP的磷酸化激活了Hippo信号通路。图3KCTD11通过上调NSCLC细胞中YAP的磷酸化水平来激活Hippo途径A-B：KCTD11过表达抑制了TEAD的转录活性。HippopGTII荧光素酶报告基因测定表明，KCTD11在A549细胞中的过表达上调了Hippo信号通路的活性，而缺失KCTD11在H1299细胞中则抑制了Hippo信号通路的活性。实验用对照或wnt3a条件培养基处理6小时。C-D：在过表达KCTD11的A549细胞中下调了Hippo通路的目标靶基因CTGF，CYR61和CyclinEmRNA表达水平，在缺失KCTD11的H1299细胞中上调了其目标靶基因的mRNA表达水平。E-F：Western印迹显示，在过表达KCTD11的A549细胞和H460细胞中，YAP的磷酸化水平增加，并且Hippo途径的靶基因CTGF和CyclinE的表达水平下调。在缺失KCTD11的H1299细胞和HBE细胞中，YAP的磷酸化水平降低，CTGF和CyclinE的表达水平上调，GAPDH用作上样对照。使用ImageJ软件分析灰度值。G–J：细胞核-细胞质蛋白分离和免疫荧光表明，在转染KCTD11后，A549细胞系中YAP的核转位受到抑制，并且
本文编号：3263693
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
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【学位级别】：硕士
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KCTD11抑制NSCLC的增殖和侵袭A-C：在过表达KCTD11的A549细胞中，集落形成测定，Transwell测定和MTT测定显示细胞的增殖和侵袭能力减小
14中国医科大学硕士学位论文补充图S1KCTD11抑制NSCLC细胞的恶性行为A–C：在过表达KCTD11的H460细胞中，集落形成测定，Transwell测定和MTT测定显示细胞的增殖和侵袭减少。D-F：而集落形成测定，Transwell测定和MTT测定表明，在缺失KCTD11的HBE细胞中，细胞的增殖和侵袭增加。G：在裸鼠中过表达KCTD11并饲养6周后未进行解剖的裸鼠的照片。H：与对照组（n=7）相比，向裸鼠（n=7）的尾静脉注射稳定表达KCTD11的A549细胞（G418筛查）减少了肺转移的病灶数。缩写：EV，空向量；NC，负控制。3.3KCTD11通过上调NSCLC细胞中YAP的磷酸化水平激活了Hippo通路通过双重荧光素酶测定，转染KCTD11上调了Hippo信号通路的活性，而敲除KCTD11抑制了Hippo信号通路的活性（图3A-B）。然后，研究发现在KCTD11过表达的A549细胞中，与Hippo信号通路相关的靶基因CTGF，CYR61和cyclinEmRNA被下调，而在KCTD11敲除的H1299细胞中被上调（图3C-D），表明KCTD11参与Hippo信号通路。因此，我们很好奇KCTD11在Hippo通路信号转导过程中是否参与调节YAP/P-YAP的表达。在过表达KCTD11的A549细胞和H460细胞系以及缺乏内源性KCTD11的H1299和HBE细胞系中，YAP，LATS1均未见明显变化，但研究发现P-YAP被KCTD11明显上调。当研究中敲除内源性KCTD11时，我们观察到在H1299细胞和HBE细胞中P-YAP被下调。与增殖相关的基因CyclinE和CTGF在KCTD11过表达的细胞系被下调，而在缺乏
15中国医科大学硕士学位论文内源性KCTD11表达的细胞系被上调（图3E-F）。通过细胞核-细胞质蛋白分离和免疫荧光，我们还发现YAP的核转位在转染KCTD11的A549细胞系中受到抑制。图3G，I）。在H1299细胞系中结果相反，KCTD11的敲除促进了YAP的核易位（图3H，J）。因此，这些结果表明KCTD11通过促进YAP的磷酸化激活了Hippo信号通路。图3KCTD11通过上调NSCLC细胞中YAP的磷酸化水平来激活Hippo途径A-B：KCTD11过表达抑制了TEAD的转录活性。HippopGTII荧光素酶报告基因测定表明，KCTD11在A549细胞中的过表达上调了Hippo信号通路的活性，而缺失KCTD11在H1299细胞中则抑制了Hippo信号通路的活性。实验用对照或wnt3a条件培养基处理6小时。C-D：在过表达KCTD11的A549细胞中下调了Hippo通路的目标靶基因CTGF，CYR61和CyclinEmRNA表达水平，在缺失KCTD11的H1299细胞中上调了其目标靶基因的mRNA表达水平。E-F：Western印迹显示，在过表达KCTD11的A549细胞和H460细胞中，YAP的磷酸化水平增加，并且Hippo途径的靶基因CTGF和CyclinE的表达水平下调。在缺失KCTD11的H1299细胞和HBE细胞中，YAP的磷酸化水平降低，CTGF和CyclinE的表达水平上调，GAPDH用作上样对照。使用ImageJ软件分析灰度值。G–J：细胞核-细胞质蛋白分离和免疫荧光表明，在转染KCTD11后，A549细胞系中YAP的核转位受到抑制，并且
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