C/EBPβ在人正常肝细胞和肝癌细胞系中的差异表达及其与内质网应激相关细胞死亡的关系
发布时间：2021-07-10 05:30
目的观察转录因子C/EBPβ在人永生化正常肝细胞和肝癌细胞系中的表达差异性,探讨其与肝癌细胞内质网应激介导的细胞死亡的相关性。方法培养人永生化正常肝细胞系HHL5、HL7702和肝癌SMMC7721、Bel7402、HepG2、Hep3B细胞系;Hep3B细胞用衣霉素诱导内质网应激细胞模型;倒置光学显微镜下观察细胞形态;MTT法检测细胞生长抑制率;Hoechst 33258染色后荧光显微镜下检测细胞凋亡;RT-PCR和Western blotting技术分别检测mRNA和蛋白的表达水平。结果 C/EBPβ的mRNA和蛋白亚型C/EBPβ-1在4种人肝癌细胞系和永生化正常肝细胞系中均有表达,但C/EBPβ-3仅在人永生化正常肝细胞系中表达,在肝癌细胞系中不表达;衣霉素能够上调人肝癌Hep3B细胞C/EBPβ的mRNA和蛋白表达水平,明显上调C/EBPβ-3的表达水平;衣霉素能够诱导人肝癌Hep3B细胞内质网应激介导的细胞死亡,表现为细胞凋亡和类凋亡两种方式。结论 C/EBPβ的蛋白亚型C/EBPβ-3在人永生化正常肝细胞中表达而在肝癌细胞中不表达;C/EBPβ参与内质网应激介导的人肝癌细...
【文章来源】：西安交通大学学报(医学版). 2017,38(04)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
图１Ｃ／ＥＢＰβ在人永生化正常肝细胞系和肝癌细胞系中的表达情况Ｆｉｇ．１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＣ／ＥＢＰβｉｎｈｕｍａｎｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄｎｏｒｍａｌ
ｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ２．２衣霉素对人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞中Ｃ／ＥＢＰβ表达的影响ＲＴ－ＰＣＲ结果显示，衣霉素（公认内质网应激激活剂［５］）可浓度依赖性上调人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞中Ｃ／ＥＢＰβ的ｍＲＮＡ转录（图２Ａ）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ－ｔｉｎｇ结果显示，衣霉素能够同时上调Ｃ／ＥＢＰβ３种蛋白亚型Ｃ／ＥＢＰβ－１、２、３的表达，其中以Ｃ／ＥＢＰβ－３上调更为明显（图２Ｂ）。图２衣霉素上调人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞的Ｃ／ＥＢＰβ表达Ｆｉｇ．２ＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣ／ＥＢＰβｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａＨｅｐ３ＢｃｅｌｌｓＡ：衣霉素浓度依赖性上调人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞中Ｃ／ＥＢＰβ的ｍＲ－ＮＡ表达水平；Ｂ：衣霉素浓度依赖性上调人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞中Ｃ／ＥＢＰβ３种蛋白亚型Ｃ／ＥＢＰβ－１、２、３的表达水平。ＴＭ：衣霉素。２．３衣霉素对人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞死亡的影响ＭＴＴ法结果显示，衣霉素能够浓度依赖性抑制人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞的生长（图３Ａ）。用衣霉素处理人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞后，通过Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色，发现衣霉素处理组细胞出现细胞核皱缩和核碎裂（图３Ｂ）。此外，在倒置光镜显微镜下观察到细胞内空泡形成（细胞发生类凋亡后的特征性表现［６］）（图３Ｃ）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示，衣霉素能够浓度依赖性上调内质网应激特
４期卢新兰，卢桂芳，王新，等．Ｃ／ＥＢＰβ在人正常肝细胞和肝癌细胞系中的差异表达及其与内质网应激相关细胞死亡的关系ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｄｙｘｂ．ｃｎ；ｈｔｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ震荡１０ｍｉｎ，将酶标仪的吸收波长设定为４９０ｎｍ，然后将９６孔板置入酶联免疫检测仪（酶标仪）中，测定各孔的相对吸光度值（Ａ值）。细胞抑制率（％）＝（１－实验组Ａ值／对照组Ａ值）×１００％。１．２．３Ｈｏｅｃｈｓｔ染色测定细胞凋亡将１０ｍｍ×１０ｍｍ的盖玻片放入６孔板中，取对数生长期人肝细胞癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞常规消化、离心后，以５×１０５个／孔将细胞悬液接种于６孔板中，将其轻轻移入培养箱中培养。２４ｈ后，弃上清，未加衣霉素干预者为对照组，实验组用衣霉素工作液１０μｇ／ｍＬ处理细胞。２４ｈ后吸掉旧培养基，加入５００μＬ固定液，室温下固定１５ｍｉｎ后，ＰＢＳ洗涤。加入５００μＬ的Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色液，室温下避光染色５ｍｉｎ。ＰＢＳ洗涤后滴１滴９５０ｍＬ／Ｌ甘油于载玻片上，用盖玻片盖上，使盖玻片贴有细胞的面接触封片液。荧光显微镜下观察细胞核的颜色及形态改变并拍照。１．２．４ＲＴ－ＰＣＲ法测定ｍＲＮＡ表达水平提取上述各细胞系或衣霉素处理后的各组Ｈｅｐ３Ｂ细胞中的总ＲＮＡ，参照ＧｅｎＢａｎｋ中Ｃ／ＥＢＰβ序列引物设计，序列如下，上游：５′－ＧＴＴＣＡＴＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧ－３′，下游：５′－ＡＡＧＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＣＧＴＡＧＴＡＧＡＡ－Ｇ－
本文编号：3275285
【文章来源】：西安交通大学学报(医学版). 2017,38(04)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
图１Ｃ／ＥＢＰβ在人永生化正常肝细胞系和肝癌细胞系中的表达情况Ｆｉｇ．１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＣ／ＥＢＰβｉｎｈｕｍａｎｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄｎｏｒｍａｌ
ｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ２．２衣霉素对人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞中Ｃ／ＥＢＰβ表达的影响ＲＴ－ＰＣＲ结果显示，衣霉素（公认内质网应激激活剂［５］）可浓度依赖性上调人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞中Ｃ／ＥＢＰβ的ｍＲＮＡ转录（图２Ａ）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ－ｔｉｎｇ结果显示，衣霉素能够同时上调Ｃ／ＥＢＰβ３种蛋白亚型Ｃ／ＥＢＰβ－１、２、３的表达，其中以Ｃ／ＥＢＰβ－３上调更为明显（图２Ｂ）。图２衣霉素上调人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞的Ｃ／ＥＢＰβ表达Ｆｉｇ．２ＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣ／ＥＢＰβｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａＨｅｐ３ＢｃｅｌｌｓＡ：衣霉素浓度依赖性上调人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞中Ｃ／ＥＢＰβ的ｍＲ－ＮＡ表达水平；Ｂ：衣霉素浓度依赖性上调人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞中Ｃ／ＥＢＰβ３种蛋白亚型Ｃ／ＥＢＰβ－１、２、３的表达水平。ＴＭ：衣霉素。２．３衣霉素对人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞死亡的影响ＭＴＴ法结果显示，衣霉素能够浓度依赖性抑制人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞的生长（图３Ａ）。用衣霉素处理人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞后，通过Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色，发现衣霉素处理组细胞出现细胞核皱缩和核碎裂（图３Ｂ）。此外，在倒置光镜显微镜下观察到细胞内空泡形成（细胞发生类凋亡后的特征性表现［６］）（图３Ｃ）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示，衣霉素能够浓度依赖性上调内质网应激特
４期卢新兰，卢桂芳，王新，等．Ｃ／ＥＢＰβ在人正常肝细胞和肝癌细胞系中的差异表达及其与内质网应激相关细胞死亡的关系ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｄｙｘｂ．ｃｎ；ｈｔｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ震荡１０ｍｉｎ，将酶标仪的吸收波长设定为４９０ｎｍ，然后将９６孔板置入酶联免疫检测仪（酶标仪）中，测定各孔的相对吸光度值（Ａ值）。细胞抑制率（％）＝（１－实验组Ａ值／对照组Ａ值）×１００％。１．２．３Ｈｏｅｃｈｓｔ染色测定细胞凋亡将１０ｍｍ×１０ｍｍ的盖玻片放入６孔板中，取对数生长期人肝细胞癌Ｈｅｐ３Ｂ细胞常规消化、离心后，以５×１０５个／孔将细胞悬液接种于６孔板中，将其轻轻移入培养箱中培养。２４ｈ后，弃上清，未加衣霉素干预者为对照组，实验组用衣霉素工作液１０μｇ／ｍＬ处理细胞。２４ｈ后吸掉旧培养基，加入５００μＬ固定液，室温下固定１５ｍｉｎ后，ＰＢＳ洗涤。加入５００μＬ的Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色液，室温下避光染色５ｍｉｎ。ＰＢＳ洗涤后滴１滴９５０ｍＬ／Ｌ甘油于载玻片上，用盖玻片盖上，使盖玻片贴有细胞的面接触封片液。荧光显微镜下观察细胞核的颜色及形态改变并拍照。１．２．４ＲＴ－ＰＣＲ法测定ｍＲＮＡ表达水平提取上述各细胞系或衣霉素处理后的各组Ｈｅｐ３Ｂ细胞中的总ＲＮＡ，参照ＧｅｎＢａｎｋ中Ｃ／ＥＢＰβ序列引物设计，序列如下，上游：５′－ＧＴＴＣＡＴＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧ－３′，下游：５′－ＡＡＧＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＣＧＴＡＧＴＡＧＡＡ－Ｇ－
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