gMYL6功能片段的鉴定及作用机制研究
发布时间：2021-07-15 18:16
目的 从人脐血中分化诱导出具有高度活性的NK细胞。构建体外筛选模型,筛选出g MYL6系列小肽中能增强NK细胞活性的小肽。在活性肽介入后,探究NK细胞对K562细胞增殖和凋亡方面的影响,并确定其抑制肿瘤细胞的作用方式,最终阐述其抑癌机制。方法1用Ficoll法从脐血中分离出单核细胞进行诱导分化出NK细胞,采用流式细胞术验证NK细胞的成熟与活性,以保证获得80%以上的成熟NK细胞。2以K562细胞为靶细胞构建体外筛选模型,小肽浓度设置25μM、50μM、100μM三个浓度梯度进行筛选,用CCK-8方法筛选出能增强NK细胞毒作用的小肽,确定一种作用最强的小肽进行下一步研究。3探究NK细胞对靶细胞增殖和凋亡的影响,采用流式细胞术评估细胞周期阻滞。4采用AO/EB荧光染色观察靶细胞凋亡,流式细胞术Annexin v/PI双染法检测细胞凋亡。5通过蛋白质印记实验探究小肽提高NK细胞杀伤活性的途径,并通过实时荧光核酸定量PCR进行验证,初步确定其抑癌机制。结果1从脐血中诱导分化出成熟具有活性的NK细胞。2经过筛选25μM小肽D增强NK细胞杀伤活性最为显著,其他浓度的各个小肽也有不同程度的作用。3小...
【文章来源】：华北理工大学河北省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NK细胞的生长历程（200×）
华北理工大学硕士学位论文-161.2.2.2人脐血来源的NK细胞成熟及活性鉴定CD3分子为T细胞特有，CD56阳性CD3阴性表示为成熟的NK细胞（图2B）。此外，还对诱导成功的NK细胞进行活性鉴定，测其活化性受体NKp30、NKG2D的表达（图2C、D）。如图所示，诱导成熟的NK细胞为85.67%。NKp30在NK细胞中表达为97%，NKG2D在NK细胞中的表达为91%，表明诱导出来的NK细胞具有高度活性。图2NK细胞的成熟及活性检测（A：收集的细胞的散点图；B：成熟的NK细胞中CD3-和CD56+的表达；C：NK细胞中表达的NKp30的百分比为97.6％；D：NKG2D的百分比为91％。）
第1章实验研究-171.2.3小肽的作用结果1.2.3.1gMYL6功能片段的筛选1）加入小肽8hNK细胞对K562细胞的杀伤活性在得到高度活性的NK细胞后，选定K562细胞为靶细胞构建体外筛选模型。以2:1为效靶比，四种小肽分别设置25μM、50μM、100μM三个浓度梯度，确定8h和16h两个时间段，采用CCK-8的方法进行筛眩在活性肽的作用下，将四种小肽分别命名为A、B、C、D，“—”表示没有提高。结果显示活性肽D在25μM时提高NK细胞的杀伤率最大为（10.62±1.73）%；各组小肽在不同浓度时提高NK细胞的杀伤率见表11。NK细胞与K562细胞共孵育8h的杀伤率见图3。表11小肽作用8h后提高NK细胞的杀伤率组别提高杀伤率(%)25μM50μM100μMA肽B肽C肽D肽1.25±0.89—8.22±1.0210.62±1.731.78±0.660.72±0.215.75±0.545.98±0.320.64±0.11——3.06±0.42图3小肽作用8h后NK细胞对K562细胞的杀伤率注：*：P<0.05，**：P<0.012）加入小肽16hNK细胞对K562细胞的杀伤活性
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗肿瘤多肽研究进展[J]. 刘娟娟,李丹阳,孙正阳,孟浩毅,金媛媛,杨兆勇. 济宁医学院学报. 2017(04)
[2]NK细胞应用于肿瘤免疫治疗的研究进展[J]. 任海龙,邵东燕,李琦,师俊玲,杨慧,靳明亮,黄庆生. 现代免疫学. 2017(03)
[3]NK细胞及其在靶向治疗中的应用[J]. 生时昀,冯辉. 细胞与分子免疫学杂志. 2017(05)
[4]NK细胞在肿瘤免疫治疗中的研究进展[J]. 陈力川,汪思亮,余苏云,贾琦,祝娉婷,陈文星,王爱云,陆茵. 肿瘤. 2017(01)
[5]肿瘤免疫治疗新进展及面临挑战[J]. 张秀丽,仝莹莹,张莲,陈思宇. 癌症进展. 2016(02)
[6]基于NK细胞的肿瘤免疫研究进展[J]. 杜锦芳,潘树芳,孙珏,周诣,石晓兰. 现代肿瘤医学. 2016(04)
[7]肿瘤免疫治疗研究进展[J]. 韩策,尤向辉,聂娜,宋扬. 陕西医学杂志. 2015(04)
[8]抗菌肽及抗癌生物活性肽抗肿瘤机制研究进展[J]. 夏龙,欧阳晓晖,苏秀兰. 世界最新医学信息文摘. 2015(08)
[9]肿瘤免疫治疗现状[J]. 焦顺昌. 中国新药杂志. 2014(17)
[10]抗肿瘤多肽研究进展[J]. 韩笑,李娜,杜培革. 中国生物工程杂志. 2013(06)
博士论文
[1]外周血Treg细胞及NKG2D+NK细胞表达在结直肠癌患者中的临床意义[D]. 沈亚娟.山东大学 2014
本文编号：3286219
【文章来源】：华北理工大学河北省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NK细胞的生长历程（200×）
华北理工大学硕士学位论文-161.2.2.2人脐血来源的NK细胞成熟及活性鉴定CD3分子为T细胞特有，CD56阳性CD3阴性表示为成熟的NK细胞（图2B）。此外，还对诱导成功的NK细胞进行活性鉴定，测其活化性受体NKp30、NKG2D的表达（图2C、D）。如图所示，诱导成熟的NK细胞为85.67%。NKp30在NK细胞中表达为97%，NKG2D在NK细胞中的表达为91%，表明诱导出来的NK细胞具有高度活性。图2NK细胞的成熟及活性检测（A：收集的细胞的散点图；B：成熟的NK细胞中CD3-和CD56+的表达；C：NK细胞中表达的NKp30的百分比为97.6％；D：NKG2D的百分比为91％。）
第1章实验研究-171.2.3小肽的作用结果1.2.3.1gMYL6功能片段的筛选1）加入小肽8hNK细胞对K562细胞的杀伤活性在得到高度活性的NK细胞后，选定K562细胞为靶细胞构建体外筛选模型。以2:1为效靶比，四种小肽分别设置25μM、50μM、100μM三个浓度梯度，确定8h和16h两个时间段，采用CCK-8的方法进行筛眩在活性肽的作用下，将四种小肽分别命名为A、B、C、D，“—”表示没有提高。结果显示活性肽D在25μM时提高NK细胞的杀伤率最大为（10.62±1.73）%；各组小肽在不同浓度时提高NK细胞的杀伤率见表11。NK细胞与K562细胞共孵育8h的杀伤率见图3。表11小肽作用8h后提高NK细胞的杀伤率组别提高杀伤率(%)25μM50μM100μMA肽B肽C肽D肽1.25±0.89—8.22±1.0210.62±1.731.78±0.660.72±0.215.75±0.545.98±0.320.64±0.11——3.06±0.42图3小肽作用8h后NK细胞对K562细胞的杀伤率注：*：P<0.05，**：P<0.012）加入小肽16hNK细胞对K562细胞的杀伤活性
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗肿瘤多肽研究进展[J]. 刘娟娟,李丹阳,孙正阳,孟浩毅,金媛媛,杨兆勇. 济宁医学院学报. 2017(04)
[2]NK细胞应用于肿瘤免疫治疗的研究进展[J]. 任海龙,邵东燕,李琦,师俊玲,杨慧,靳明亮,黄庆生. 现代免疫学. 2017(03)
[3]NK细胞及其在靶向治疗中的应用[J]. 生时昀,冯辉. 细胞与分子免疫学杂志. 2017(05)
[4]NK细胞在肿瘤免疫治疗中的研究进展[J]. 陈力川,汪思亮,余苏云,贾琦,祝娉婷,陈文星,王爱云,陆茵. 肿瘤. 2017(01)
[5]肿瘤免疫治疗新进展及面临挑战[J]. 张秀丽,仝莹莹,张莲,陈思宇. 癌症进展. 2016(02)
[6]基于NK细胞的肿瘤免疫研究进展[J]. 杜锦芳,潘树芳,孙珏,周诣,石晓兰. 现代肿瘤医学. 2016(04)
[7]肿瘤免疫治疗研究进展[J]. 韩策,尤向辉,聂娜,宋扬. 陕西医学杂志. 2015(04)
[8]抗菌肽及抗癌生物活性肽抗肿瘤机制研究进展[J]. 夏龙,欧阳晓晖,苏秀兰. 世界最新医学信息文摘. 2015(08)
[9]肿瘤免疫治疗现状[J]. 焦顺昌. 中国新药杂志. 2014(17)
[10]抗肿瘤多肽研究进展[J]. 韩笑,李娜,杜培革. 中国生物工程杂志. 2013(06)
博士论文
[1]外周血Treg细胞及NKG2D+NK细胞表达在结直肠癌患者中的临床意义[D]. 沈亚娟.山东大学 2014
本文编号：3286219
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