Engrailed-2蛋白单克隆抗体的制备与鉴定及其在前列腺癌中的表达
发布时间：2021-08-07 10:52
目 的1.人体前列腺癌和前列腺增生组织中Engrailed-2基因mRNA的表达2.Engrailed-2蛋白单克隆抗体的制备与鉴定3.人体前列腺癌和前列腺增生组织中Engrailed-2蛋白的表达方 法分别收集临床病理确诊的前列腺癌组织标本20例,前列腺增生组织标本25例,使用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR）检测人体前列腺癌和前列腺增生组织标本中Engrailed-2基因mRNA的表达。将Homeobox Engrailed-2基因（NM001427.3）C末端114aa序列连接到基因表达载体pET-28a,转染大肠杆菌,表达纯化EN2重组蛋白。用该EN2重组蛋白免疫小鼠,使用杂交瘤技术筛选表达EN2单克隆抗体的细胞株,使用ELISA、Western Blotting、免疫组化等方法鉴定抗体性质,将阳性细胞株接种到小鼠腹腔进行EN2单克隆抗体的大量制备。随后,使用EN2单克隆抗体对人体前列腺癌和前列腺增生组织进行免疫组化,分析EN2蛋白在人体前列腺癌组织和前列腺增生组织中的表达差异。结 果20例人体前列腺...
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３．?３．?２?９６孔酶标板测定抗体效价示意图??Ｂ、Ｃ、Ｄ三行用于血清效价测定
?３方法???（４）电泳：以８０Ｖ的电压进行浓缩胶电泳，待蛋白样品电泳至浓缩胶分离??胶交界处，调整电泳条件为１２０Ｖ，继续电泳至蛋白样品距ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶下方１??厘米左右，停止电泳；??（５）半干式电转：将滤纸剪裁为５ｃｍｘ８ｃｍ大小，叠加在一起（１２张一沓），??放入电转液中浸润，电转槽底部涂抹上少量电转液，润湿即可，按照图３．５．３所??示顺序分别放置厚滤纸，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白胶和ＮＣ膜，注意正负极方向且正负极??的厚滤纸不能直接接触，保证电流经正极—厚滤纸￣？ＮＣ膜—ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白胶??—厚滤纸—负极穿过整个系统。定流２５ｍＡ，室温电转２小时；??（６）封闭：配置５０ｍｌ的５％脱脂奶粉，将整片ＮＣ膜浸没入脱脂奶粉封闭??液中，４°Ｃ过夜孵育；??（７）加一抗：将纯化好的ＥＮ２单抗稀释为统一的１００以／ｍＬ，在５ｍＬＥＰ管??中各配置３?ｍＬ—抗，在ＮＣ膜下方编号，将各个泳道剪裁开，分别放入不同的??一抗中，室温摇床孵育１小时；??（８）加二抗：弃去ＥＰ管中的一抗，加入０．１％的：ＰＢＳＴ室温摇床５ｍｉｎ，洗??５遍，配置１：１００００山羊抗小鼠ＩｇＧ抗体－ＨＲＰ二抗，ＮＣ膜条带放入其中，室??温摇床孵育１小时；??（９）显色：将ＮＣ膜条带取出，使用０．１％的ＰＢＳＴ室温摇床５ｍｉｎ，洗１０??遍。按照显色液Ａ液：Ｂ液＝１：１配置，滴加到ＮＣ膜条带上，室温５－１０ｍｉｎ后，??滤纸吸干显色液，保鲜膜上下均匀覆盖；??（１０）暗室曝光显影。??示意图３．?５．?３?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ半干式电转示意图??３．５．４?ＥＮ２单克隆抗体与前列腺癌细胞系ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬＮＣａｐ细胞总蛋
５?倍，最大为?３１．４２?倍，且可以看出，组织?１?（３０．８６）、３?（２３．４２）、６?（３１．４２）、??２０?（２３．８８）的ＥＮ２基因表达更高。??２０例前列腺癌组织标本的ｑＲＴ－ＰＣＲ??４０－??３０－?ｉｊｆａ?置??Ｉ?Ｉ?ｊ?Ａ??〇?２〇－?｜??〇．ｊ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－ｇＬＴ?ｇｆＴｉｑｌ?ＴＪ?ｐ｜Ｄｌ－Ｔ－〇ｊ－Ｔ－??ＢＰＨ?１?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?１５?１６?１７?１８?１９?２０??前列腺癌组织标本??图４．?１?２０例前列腺癌和２５例前列腺增生组织标本的ｑＲＴ－ＰＣＲ??采用２￣Ａ?ＡＣｔ法进行计算，该数值大于１即表明该前列腺癌组织中ＥＮ２基因的表达高于??前列腺增生组。??４．２?Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ－２重组蛋白的原核表达??选取?ＥｎｇｒａｉｌｅｄＨｏｍｅｏｂｏｘ２?基因（ＮＭ＿００１４２７．３）的?Ｃ?末端?１１４ａａ?序列，将??２３??
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国前列腺癌的流行病学概述和启示[J]. 叶定伟,朱耀. 中华外科杂志. 2015 (04)
[2]中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析[J]. 韩苏军,张思维,陈万青,李长岭. 临床肿瘤学杂志. 2013(04)
[3]中国部分市县前列腺癌发病趋势比较研究[J]. 李鸣,张思维,马建辉,陈万青,那彦群. 中华泌尿外科杂志. 2009 (06)
[4]前列腺癌的流行病学特征及晚期一线内分泌治疗分析[J]. 马春光,叶定伟,李长岭,周芳坚,姚旭东,张世林,戴波,张海梁,朱耀,沈益君. 中华外科杂志. 2008 (12)
本文编号：3327666
【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图３．?３．?２?９６孔酶标板测定抗体效价示意图??Ｂ、Ｃ、Ｄ三行用于血清效价测定
?３方法???（４）电泳：以８０Ｖ的电压进行浓缩胶电泳，待蛋白样品电泳至浓缩胶分离??胶交界处，调整电泳条件为１２０Ｖ，继续电泳至蛋白样品距ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶下方１??厘米左右，停止电泳；??（５）半干式电转：将滤纸剪裁为５ｃｍｘ８ｃｍ大小，叠加在一起（１２张一沓），??放入电转液中浸润，电转槽底部涂抹上少量电转液，润湿即可，按照图３．５．３所??示顺序分别放置厚滤纸，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白胶和ＮＣ膜，注意正负极方向且正负极??的厚滤纸不能直接接触，保证电流经正极—厚滤纸￣？ＮＣ膜—ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白胶??—厚滤纸—负极穿过整个系统。定流２５ｍＡ，室温电转２小时；??（６）封闭：配置５０ｍｌ的５％脱脂奶粉，将整片ＮＣ膜浸没入脱脂奶粉封闭??液中，４°Ｃ过夜孵育；??（７）加一抗：将纯化好的ＥＮ２单抗稀释为统一的１００以／ｍＬ，在５ｍＬＥＰ管??中各配置３?ｍＬ—抗，在ＮＣ膜下方编号，将各个泳道剪裁开，分别放入不同的??一抗中，室温摇床孵育１小时；??（８）加二抗：弃去ＥＰ管中的一抗，加入０．１％的：ＰＢＳＴ室温摇床５ｍｉｎ，洗??５遍，配置１：１００００山羊抗小鼠ＩｇＧ抗体－ＨＲＰ二抗，ＮＣ膜条带放入其中，室??温摇床孵育１小时；??（９）显色：将ＮＣ膜条带取出，使用０．１％的ＰＢＳＴ室温摇床５ｍｉｎ，洗１０??遍。按照显色液Ａ液：Ｂ液＝１：１配置，滴加到ＮＣ膜条带上，室温５－１０ｍｉｎ后，??滤纸吸干显色液，保鲜膜上下均匀覆盖；??（１０）暗室曝光显影。??示意图３．?５．?３?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ半干式电转示意图??３．５．４?ＥＮ２单克隆抗体与前列腺癌细胞系ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬＮＣａｐ细胞总蛋
５?倍，最大为?３１．４２?倍，且可以看出，组织?１?（３０．８６）、３?（２３．４２）、６?（３１．４２）、??２０?（２３．８８）的ＥＮ２基因表达更高。??２０例前列腺癌组织标本的ｑＲＴ－ＰＣＲ??４０－??３０－?ｉｊｆａ?置??Ｉ?Ｉ?ｊ?Ａ??〇?２〇－?｜??〇．ｊ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－ｇＬＴ?ｇｆＴｉｑｌ?ＴＪ?ｐ｜Ｄｌ－Ｔ－〇ｊ－Ｔ－??ＢＰＨ?１?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?１５?１６?１７?１８?１９?２０??前列腺癌组织标本??图４．?１?２０例前列腺癌和２５例前列腺增生组织标本的ｑＲＴ－ＰＣＲ??采用２￣Ａ?ＡＣｔ法进行计算，该数值大于１即表明该前列腺癌组织中ＥＮ２基因的表达高于??前列腺增生组。??４．２?Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ－２重组蛋白的原核表达??选取?ＥｎｇｒａｉｌｅｄＨｏｍｅｏｂｏｘ２?基因（ＮＭ＿００１４２７．３）的?Ｃ?末端?１１４ａａ?序列，将??２３??
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国前列腺癌的流行病学概述和启示[J]. 叶定伟,朱耀. 中华外科杂志. 2015 (04)
[2]中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析[J]. 韩苏军,张思维,陈万青,李长岭. 临床肿瘤学杂志. 2013(04)
[3]中国部分市县前列腺癌发病趋势比较研究[J]. 李鸣,张思维,马建辉,陈万青,那彦群. 中华泌尿外科杂志. 2009 (06)
[4]前列腺癌的流行病学特征及晚期一线内分泌治疗分析[J]. 马春光,叶定伟,李长岭,周芳坚,姚旭东,张世林,戴波,张海梁,朱耀,沈益君. 中华外科杂志. 2008 (12)
本文编号：3327666
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