基于MHC Ⅰ类分子亲和力筛选的人结肠癌新抗原肽的临床免疫效应研究

发布时间：2021-11-18 16:01

　　目的:本研究通过对人结肠癌全外显子测序的生物信息学分析,预测新抗原,确定其所结合的MHC（人类为HLA）分子亲和力。体外模拟抗原提呈过程对肿瘤新生抗原肽进行免疫原性检测,阐述新抗原肽的免疫原性与其MHCⅠ类分子亲和力变化度及MHCⅠ等位基因型之间的关系。在此基础上形成快速发现有效新抗原的新方法。方法:1.采用NGS测序技术对患者肿瘤组织进行全外显子测序,获得肿瘤的全外显子基因组数据。2.通过Net-MHC4.0等软件预测（9肽）新抗原肽,确定其所结合的MHC I等位基因和分子亲和力。3.由生物公司根据新抗原多肽的氨基酸序列,合成新抗原多肽。4.体外诱导外周血单个核细胞（PBMC）分化为未成熟树突状细胞（im DC）。5.制备负载新抗原多肽的DC疫苗。6.进行DC疫苗与PBMC共培养。7.采用ELISPOT酶联斑点技术量化新抗原多肽的免疫原性。8.以流式细胞技术鉴定成熟树突状细胞（m DC）及最后共培养混合细胞中T、B、NK等各免疫细胞的百分比。结果:1.通过NGS测序技术及生物信息分析技术预测了共222种新抗原肽（来自6例结肠癌患者标本）,明确了其等位基因及其MHC分子亲和力等信息。2... 

【文章来源】：杭州师范大学浙江省

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

淋巴分离示意图

杭州师范大学硕士学位论文实验材料及方法13图2-2CD8+T细胞识别负载新抗原多肽的DC细胞简单示意图图2-2.新抗原结合HLA分子后，被APC提呈至细胞表面，最后被CDT8+T细胞表面的TCR识别，该过程即为新抗原多肽的免疫应答过程。2.2.6EliSpot酶联斑点技术测T细胞的活性1）排板设计：每个细胞悬液设置2个复孔,对照组为新制备的PBMC，同时设置试剂质控组，即由INF-γ刺激的细胞悬液做阳性对照及单纯培养基做阴性对照。2）用200μLRPMI1640培养基填充微孔板中的所有孔，并在室温下孵育约20min。3）收集最后全部混合细胞后，1500rpm，离心5min，用RPMI1640培养基重悬再清洗1次，最后将细胞悬液的容量调整为200ul。4）准备好接种细胞后，将孔中培养基吸出，立即向每个孔中加入200μl混合细胞。5）将细胞在潮湿的培养箱（37℃，5%CO2）中孵育24小时。

杭州师范大学硕士学位论文实验结果173.2成功制备92种新抗原多肽混合DC细胞疫苗在诱导分化DC的过程中，分别于正置电子显微镜和倒置光学显微镜进行照片采集，图3-1为细胞在正置电子显微镜下由LeicaApplicationSuite(LAS)软件进行的图像采集，图3-2为倒置光学显微镜下由电子摄像机拍摄图像。图3-1正置电子显微镜下电脑软件所采集图像图3-1.从外周血中分离出的PBMC让其自然贴壁，弃去悬浮细胞，留贴壁的单核细胞培养，用细胞因子GM-CSF和IL4诱导单核细胞分化为DC。A-E组图为电子显微镜下由电脑软件采集的图片，A组图为D1天去悬浮细胞后贴壁生长的圆形单核细胞；B组图为D2天开始成团生长的贴壁细胞；C组图为D3天成团生长的贴壁细胞开始伸出伪足；D组图为D5天可见多种形态、不同伪足的半悬浮细胞，此时即为未成熟树突状细胞（imDC）；E组图为经抗原肽、CPG佐剂刺D1,50×D1,100×D1,200×D1,400×D2,50×D2,100×D2,200×D2,400×D3,50×D3,100×D3,200×D3,400×D5,50×D5,100×D5,200×D5,400×D7,50×D7,100×D7,200×D7,400×ABCDE

【参考文献】：
期刊论文
[1]肿瘤抗原肽研究新进展[J]. 刘晓军,殷小平,翁谢川,隋延仿.  国外医学(生理、病理科学与临床分册). 2000(03)



本文编号：3503192