基于CRISPR/Cas9技术建立ATRX基因敲除的HeLa细胞系

发布时间：2022-05-08 08:57

　　Ⅱ型CRISPR/Cas9系统通过sgRNA识别目标基因组序列,介导Cas9对DNA进行切割,从而引入DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）.非同源末端结合（non-homologous end joining, NHEJ）方式修复DSBs易发生基因突变从而实现特定基因的敲除。肿瘤细胞需要有维持端粒长度的机制来实现无限分裂。研究表明约85%的肿瘤依赖端粒酶的激活,15%的肿瘤则依赖端粒的替代延长机制（alternative lengthening telomeres, ALT）通过同源重组的方式维持端粒长度。胰腺内分泌细胞瘤、脑胶质细胞瘤等多种肿瘤细胞中发现ATRX基因失活与端粒的替代延长机制紧密相关。为进一步揭示ATRX在ALT激活中的作用和ATRX对肿瘤发生的作用,本课题利用CRISPR/Cas9技术建立ATRX基因敲除的HeLa细胞系。通过Western-blot在蛋白水平鉴定ATRX的表达和Sanger测序在DNA水平鉴定ATRX基因序列突变,成功建立了ATRX基因敲除的HeLa细胞系。 

【文章页数】：54 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
一 前言
    1.1 CRISPR/Cas9基因编辑技术
    1.2 ATRX基因与端粒的替代延长机制
二 实验内容
三 实验内容流程图
四 实验方法
    4.1 构建识别ATRX基因目标序列的sgRNA重组载体(pLenti-sgRNA-Lib)
    4.2 慢病毒滴度测定方法(流式细胞仪计数法)
    4.3 细胞培养相关实验方法
    4.4 细胞感染实验方法
    4.5 HeLa单克隆细胞分选方法
    4.6 T7核酸内切酶Ⅰ(T7 Endonuclease I,T7E1)酶切实验方法
    4.7 ATRX基因sgRNA切割位点Sanger测序
    4.8 BCA方法测定蛋白浓度
    4.9 Western-blot实验方法
五 实验仪器、试剂和材料
    5.1 质粒载体
    5.2 感受态菌株
    5.3 细胞
    5.4 细胞培养试剂
    5.5 PCR主要试剂
    5.6 Western-blot主要试剂
    5.7 主要试剂盒
    5.8 主要仪器设备
    5.9 主要溶剂配方
    5.10 5组ATRX基因sgRNA目标序列
    5.11 根据5组ATRX基因SgRNA目标序列设汁合成的SgRNA接头序列
    5.12 T7E1实验PCR扩增ATRX目标序列的引物
六 结果与分析
    6.1 sgRNA重组载体测序结果
    6.2 慢病毒颗粒滴度检测结果
    6.3 sgRNA重组载体感染HeLa细胞的荧光显微镜观察照片
    6.4 T7核酸内切酶I(T7E1)酶切实验结果
    6.5 Western-blot鉴定ATRX蛋白表达水平的实验结果
    6.6 编号#21的HeLa细胞株ATRX基因Sanger测序结果
七 讨论
    7.1 关于ATRX基因靶序列的选择
    7.2 识别ATRX基因目标序列的sgRNA重组载体的构建
    7.3 sgRNA重组慢病毒载体感染细胞
    7.4 T7E1实验巧步鉴定5组SgRNA介导的CRISPR/Cas9系统对ATRX目标序列的切割效率
    7.5 Western-blot在蛋白水平鉴定ATRX敲除
    7.6 Sanger测序在DNA水平分析ATRX突变机制
    7.7 对进一步研究的展望
八 参考文献
综述：CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展与应用
    参考文献
综述：ATRX基因与端粒的替代延长机制
    参考文献
致谢



本文编号：3651346