TNFα介导钙离子内流促进肝癌细胞凋亡的作用及机制研究
发布时间：2024-03-27 03:17
临床前研究结果表明TNFα诱导肿瘤细胞凋亡呈剂量依赖性。然而,临床试验发现,在肿瘤治疗过程中,TNFα治疗诱发了显著的全身性毒性,并且患者对TNFα的最大耐受剂量较低,这严重阻碍了TNFα从基础研究向临床应用的转化。如何降低TNFα的毒副作用,如何在患者可忍受的剂量范围内提高TNFα的疗效,这急需我们去解决。我们的研究团队首次发现:在肝癌细胞中,TNFα能够诱导钙离子内流,并呈剂量依赖性。文献报道,细胞内钙离子(Ca2+)水平的变化与多种细胞活动密切相关。胞内钙离子的浓度能够决定细胞“生”与“死”。我们研究进一步发现TNFα诱导钙离子内流与细胞凋亡密切相关。基于此,我们提出本课题的科学假说:TNFα诱导钙离子内流促进细胞凋亡;通过调控肝癌细胞钙离子摄入,放大TNFα介导的细胞凋亡;联合应用TNFα和钙离子摄取药物,能够有效提高抗肿瘤药物TNFα的肿瘤杀伤效果。【目的】本课题以肝细胞癌为研究对象,明确TNFα具有诱导钙离子内流的作用,探索TNFα诱导钙离子内流促进细胞凋亡的作用及机制研究。【方法】1.利用Fura-2/AM活细胞染色,分析肝癌细胞胞浆钙离子水平的变化...
【文章页数】：116 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
缩略语表
中文摘要
ABSTRACT
前言
文献回顾
第一部分 TNFΑ诱导肝癌细胞钙离子内流的作用研究
1 材料
1.1 研究对象
1.2 主要试剂
1.3 仪器耗材
2 方法
2.1 细胞复苏
2.2 细胞传代
2.3 细胞冻存
2.4 细胞胞浆钙离子染色(Fura-2/AM染料法)
2.5 细胞胞浆钙离子水平检测
3 结果
3.1 TNFα诱导HCC细胞胞浆钙离子水平升高
3.2 TNFα诱导HCC细胞胞外钙离子内流
4 讨论
第二部分 TNFΑ诱导钙离子内流的机制研究
1 材料
1.1 研究对象
1.2 主要试剂
1.3 仪器耗材
2 方法
2.1 细胞胞浆钙离子染色(Fura-2/AM染色法)
2.2 细胞胞浆钙离子水平检测
2.3 siRNA片段转染
2.4 real-timePCR检测靶基因在肝癌细胞中的mRNA表达水平
2.5 免疫印迹检测特定蛋白表达水平
2.6 免疫共沉淀
3 结果
3.1 qPCR和Westernblot检测TNFR1和TNFR2在SNU739和HLF细胞中的表达水平
3.2 siRNA片段靶向沉默TNFR1
3.3 siRNA靶向沉默TNFR1对TNFR2的反馈调节
3.4 沉默TNFR1对TNFα诱导的钙离子内流的影响
3.5 电压型离子通道抑制剂对TNFα诱导的钙离子内流的影响
3.6 TRP通道抑制剂对TNFα诱导的钙离子内流的影响
3.7 qPCR检测多种TRP通道分子的mRNA表达水平
3.8 siRNA靶向沉默TRPM7
3.9 沉默TRPM7对TNFα介导的胞外钙离子内流的影响
3.10 TNFα激活TRPM7通道的机制研究
4 讨论
第三部分 TNFΑ诱导钙离子内流促进细胞凋亡的作用研究
1 材料
1.1 研究对象
1.2 主要试剂
1.3 仪器耗材
2 方法
2.1 细胞培养
2.2 细胞胞浆钙离子水平的检测(Fura-2/AM)
2.3 免疫印迹
2.4 pcDNA3.1-PV质粒的构建
2.5 构建稳定过表达PV基因的肝癌细胞株质
2.6 siRNA片段的转染
2.7 裸鼠皮下成瘤
2.8 裸鼠尾静脉注射及肿瘤大小测量
2.9 TUNEL检测细胞凋亡
2.10 流式细胞术检测细胞凋亡
3 结果
3.1 BAPTA-AM螯合胞浆钙离子抑制TNFα诱导的细胞凋亡
3.2 过表达PV蛋白抑制TNFα诱导的细胞凋亡
3.3 抑制TRP通道抑制TNFα诱导的细胞凋亡
3.4 沉默TRPM7通道抑制TNFα诱导的细胞凋亡
3.5 体内实验：过表达PV蛋白抑制TNFα介导的抗肿瘤生长作用
3.6 过表达PV蛋白抑制抗肿瘤药物TNFα诱导的细胞凋亡
3.7 离子霉素诱导胞浆钙离子水平升高促进TNFα介导的细胞凋亡
3.8 IP3诱导胞浆钙离子水平升高促进TNFα介导的细胞凋亡
3.9 体内实验：离子霉素联合TNFα治疗抑制肝癌细胞生长
3.10 离子霉素联合TNFα显著提高TNFα的肿瘤杀伤活性
4 讨论
第四部分 TNFΑ诱导钙离子内流促进肝癌细胞凋亡的机制研究
1 材料
1.1 研究对象
1.2 主要试剂
1.3 仪器耗材
2 方法
2.1 细胞培养
2.2 calpain酶活性检测
2.3 免疫印迹
2.4 线粒体膜电位检测(TMRM法)
2.5 线粒体染色(Mito-TrackerRed)
2.6 免疫荧光
3 结果
3.1 TNFα诱导钙离子内流激活calpain酶
3.2 TNFα激活calpain促进抗凋亡蛋白cIAP2,XIAP水解
3.3 TNFα激活calpain促进caspase3活化
3.4 靶向沉默TNFR1对calpain酶活性的影响
3.5 calpeptin抑制calpain阻断TNFα介导的细胞凋亡
3.6 过表达PV对TNFα介导的TNFα/Ca2+/calpain信号通路的影响
3.7 离子霉素对TNFα介导的TNFα/Ca2+/calpain信号通路的影响
3.8 TNFα处理对肝癌细胞线粒体膜电位的影响
3.9 TNFα处理对肝癌细胞细胞色素c亚定位的影响
3.10 TNFα处理对Bcl-2家族分子转位的影响
4 讨论
小结
参考文献
附录
个人简历和研究成果
致谢
本文编号：3940113
【文章页数】：116 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
缩略语表
中文摘要
ABSTRACT
前言
文献回顾
第一部分 TNFΑ诱导肝癌细胞钙离子内流的作用研究
1 材料
1.1 研究对象
1.2 主要试剂
1.3 仪器耗材
2 方法
2.1 细胞复苏
2.2 细胞传代
2.3 细胞冻存
2.4 细胞胞浆钙离子染色(Fura-2/AM染料法)
2.5 细胞胞浆钙离子水平检测
3 结果
3.1 TNFα诱导HCC细胞胞浆钙离子水平升高
3.2 TNFα诱导HCC细胞胞外钙离子内流
4 讨论
第二部分 TNFΑ诱导钙离子内流的机制研究
1 材料
1.1 研究对象
1.2 主要试剂
1.3 仪器耗材
2 方法
2.1 细胞胞浆钙离子染色(Fura-2/AM染色法)
2.2 细胞胞浆钙离子水平检测
2.3 siRNA片段转染
2.4 real-timePCR检测靶基因在肝癌细胞中的mRNA表达水平
2.5 免疫印迹检测特定蛋白表达水平
2.6 免疫共沉淀
3 结果
3.1 qPCR和Westernblot检测TNFR1和TNFR2在SNU739和HLF细胞中的表达水平
3.2 siRNA片段靶向沉默TNFR1
3.3 siRNA靶向沉默TNFR1对TNFR2的反馈调节
3.4 沉默TNFR1对TNFα诱导的钙离子内流的影响
3.5 电压型离子通道抑制剂对TNFα诱导的钙离子内流的影响
3.6 TRP通道抑制剂对TNFα诱导的钙离子内流的影响
3.7 qPCR检测多种TRP通道分子的mRNA表达水平
3.8 siRNA靶向沉默TRPM7
3.9 沉默TRPM7对TNFα介导的胞外钙离子内流的影响
3.10 TNFα激活TRPM7通道的机制研究
4 讨论
第三部分 TNFΑ诱导钙离子内流促进细胞凋亡的作用研究
1 材料
1.1 研究对象
1.2 主要试剂
1.3 仪器耗材
2 方法
2.1 细胞培养
2.2 细胞胞浆钙离子水平的检测(Fura-2/AM)
2.3 免疫印迹
2.4 pcDNA3.1-PV质粒的构建
2.5 构建稳定过表达PV基因的肝癌细胞株质
2.6 siRNA片段的转染
2.7 裸鼠皮下成瘤
2.8 裸鼠尾静脉注射及肿瘤大小测量
2.9 TUNEL检测细胞凋亡
2.10 流式细胞术检测细胞凋亡
3 结果
3.1 BAPTA-AM螯合胞浆钙离子抑制TNFα诱导的细胞凋亡
3.2 过表达PV蛋白抑制TNFα诱导的细胞凋亡
3.3 抑制TRP通道抑制TNFα诱导的细胞凋亡
3.4 沉默TRPM7通道抑制TNFα诱导的细胞凋亡
3.5 体内实验：过表达PV蛋白抑制TNFα介导的抗肿瘤生长作用
3.6 过表达PV蛋白抑制抗肿瘤药物TNFα诱导的细胞凋亡
3.7 离子霉素诱导胞浆钙离子水平升高促进TNFα介导的细胞凋亡
3.8 IP3诱导胞浆钙离子水平升高促进TNFα介导的细胞凋亡
3.9 体内实验：离子霉素联合TNFα治疗抑制肝癌细胞生长
3.10 离子霉素联合TNFα显著提高TNFα的肿瘤杀伤活性
4 讨论
第四部分 TNFΑ诱导钙离子内流促进肝癌细胞凋亡的机制研究
1 材料
1.1 研究对象
1.2 主要试剂
1.3 仪器耗材
2 方法
2.1 细胞培养
2.2 calpain酶活性检测
2.3 免疫印迹
2.4 线粒体膜电位检测(TMRM法)
2.5 线粒体染色(Mito-TrackerRed)
2.6 免疫荧光
3 结果
3.1 TNFα诱导钙离子内流激活calpain酶
3.2 TNFα激活calpain促进抗凋亡蛋白cIAP2,XIAP水解
3.3 TNFα激活calpain促进caspase3活化
3.4 靶向沉默TNFR1对calpain酶活性的影响
3.5 calpeptin抑制calpain阻断TNFα介导的细胞凋亡
3.6 过表达PV对TNFα介导的TNFα/Ca2+/calpain信号通路的影响
3.7 离子霉素对TNFα介导的TNFα/Ca2+/calpain信号通路的影响
3.8 TNFα处理对肝癌细胞线粒体膜电位的影响
3.9 TNFα处理对肝癌细胞细胞色素c亚定位的影响
3.10 TNFα处理对Bcl-2家族分子转位的影响
4 讨论
小结
参考文献
附录
个人简历和研究成果
致谢
本文编号：3940113
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/3940113.html
