hsa c irc 0 006602/miR-224/Rac1调节轴对骨肉瘤细胞的增殖和侵袭的影响
发布时间：2024-04-08 20:40
研究背景骨肉瘤属于原发于骨质的恶性肿瘤的一种,好发于青少年人群,死亡率高。尽管采取手术,辅助化疗和放疗等治疗策略,但骨肉瘤病人的5年生存率仍很低。因此,寻找参与肿瘤发展的新分子可以为骨肉瘤患者的诊治提供新策略。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类产生于RNA前体的反向剪接过程的不含5’端帽和3’ polyA尾结构的RNA。多种生命体中均可检测到稳定存在的circRNAs,并可通过miRNA调控下游mRNA表达,在癌症进展中发挥着重要作用,已成为当前的研究热点。Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1),属于RHO GTPases家族成员,研究报道其在多种恶性肿瘤中普遍上调,且Rac1的激活与肿瘤增殖和转移密切相关。我们前期预实验发现,hsa-circ0006602在骨肉瘤癌组织中表达上调,并可能通过circRNA-miRNA-mRNA网络调控参与骨肉瘤的进展。本课题拟通过实验研究探讨hsacirc0006602/miR-224/Rac1调控轴对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。研究目的本实验拟对骨肉瘤组织...
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
1 引言
2 材料
2.1 组织
2.2 细胞株和菌株
2.3 动物来源
2.4 质粒载体
2.5 引物
2.6 主要试剂耗材
2.7 主要仪器设备
2.8 主要实验试剂配制
2.8.1 配置细胞完全培养基
2.8.2 琼脂糖凝胶制备
2.8.3 配置磷酸盐缓冲溶液
2.8.4 配置0.25%EDTA胰蛋白酶
2.8.5 配置冻存液
2.8.6 配置TBST缓冲液
2.8.7 5×转膜缓冲液的配置
2.8.8 5×电泳缓冲液的配置
2.8.9 配置封闭液
2.8.10 溶解miR-224 mimics、miR-224 inhibitor、hsacirc0006602 siRNA与NC
2.8.11 配置LB液体培养基
2.8.12 配置LB固体培养基
2.8.13 配置过硫酸铵溶液
3 实验方法
3.1 实时荧光定量PCR检测骨肉瘤癌组织及其癌旁组织中hsacirc0006602、Rac1 mRNA和miR-224的表达水平
3.1.1 提取骨肉瘤癌组织及其癌旁组织中总RNA
3.1.2 hsacirc0006602与Rac1的cDNA合成与qRT-PCR反应
3.1.3 miR-224的cDNA合成与qRT-PCR反应
3.2 细胞操作方法
3.2.1 细胞复苏
3.2.2 细胞培养条件
3.2.3 细胞传代
3.2.4 细胞冻存
3.3 测序鉴定hsacirc0006602在骨肉瘤细胞中存在
3.3.1 提取细胞中总RNA
3.3.2 逆转录为cDNA
3.3.3 人基因组DNA提取
3.3.4 PCR扩增
3.3.5 琼脂糖凝胶回收DNA片段
3.3.6 T载体连接
3.3.7 转化
3.3.8 蓝白斑筛选
3.4 实时定量PCR检测骨肉瘤细胞与正常成骨细胞中hsacirc0006602、Rac1 mRNA和miR-224的表达水平
3.4.1 提取细胞中总RNA
3.4.2 逆转录为cDNA
3.4.3 细胞的实时定量PCR反应
3.5 免疫印记检测Rac1在骨肉瘤癌组织及其癌旁组织中的表达
3.5.1 骨肉瘤组织总蛋白的提取
3.5.2 配置SDS-PAGE胶
3.5.3 免疫印迹实验步骤
3.6 免疫印记检测骨肉瘤细胞与hFOB1.19细胞中蛋白表达
3.6.1 细胞中总蛋白的提取
3.6.2 SDS-PAGE胶
3.6.3 免疫印记实验
3.7 MG63细胞转染
3.7.1 细胞的转染
3.7.2 实时定量PCR检测细胞转染效率
3.7.3 转染所用RNA序列
3.8 CCK-8检测细胞活性
3.9 Transwell实验检测细胞侵袭
3.10 检测细胞迁移(划痕实验)
3.11 生物信息学预测
3.12 双荧光素酶报告实验测定结合
3.12.1 提取基因组DNA
3.12.2 hsacirc0006602与Rac1野生型和突变型载体构建
3.12.3 双荧光素酶报告实验
3.13 hsacirc0006602 siRNA稳定转染细胞株获得与筛选
3.13.1 筛选浓度确定
3.13.2 hsacirc0006602 siRNA稳转株鉴定
3.14 裸鼠成瘤实验
3.15 统计学分析
4 实验结果
4.1 骨肉瘤中hsacirc0006602的筛选与结构鉴定
4.1.1 hsacirc0006602的环化过程
4.1.2 hsacirc0006602的结构鉴定
4.2 骨肉瘤及癌旁组织中hsacirc0006602、miR-224和Rac1的表达
4.3 骨肉瘤细胞系和正常人成骨细胞系hFOB1.19中hsacirc0006602、miR-224和Rac1的表达
4.4 敲低hsacirc0006602对MG63细胞中hsacirc0006602、miR-224、Rac1的表达及增殖、侵袭、迁移能力的影响
4.5 构建裸鼠移植瘤模型检测hsacirc0006602对骨肉瘤细胞皮下成瘤能力影响
4.6 生物信息学分析hsacirc0006602、miR-224和Rac1间关联
4.7 双荧光素酶报告实验检测hsacirc0006602、miR-224和Rac1间匹配结合作用
4.7.1 重组载体构建
4.7.2 双荧光素酶报告实验结果
4.8 转染miR-224 mimics可致MG63细胞中Rac1表达下调
4.9 回复实验验证在骨肉瘤细胞中存在hsacirc0006602/miR-224/Rac1网络调节骨肉瘤的增殖、侵袭和迁移
5 讨论
6 结论
7 参考文献
综述 circRNA的形成机制及与骨肉瘤的相关性研究进展
参考文献
个人简历
致谢
本文编号：3948781
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
1 引言
2 材料
2.1 组织
2.2 细胞株和菌株
2.3 动物来源
2.4 质粒载体
2.5 引物
2.6 主要试剂耗材
2.7 主要仪器设备
2.8 主要实验试剂配制
2.8.1 配置细胞完全培养基
2.8.2 琼脂糖凝胶制备
2.8.3 配置磷酸盐缓冲溶液
2.8.4 配置0.25%EDTA胰蛋白酶
2.8.5 配置冻存液
2.8.6 配置TBST缓冲液
2.8.7 5×转膜缓冲液的配置
2.8.8 5×电泳缓冲液的配置
2.8.9 配置封闭液
2.8.10 溶解miR-224 mimics、miR-224 inhibitor、hsacirc0006602 siRNA与NC
2.8.11 配置LB液体培养基
2.8.12 配置LB固体培养基
2.8.13 配置过硫酸铵溶液
3 实验方法
3.1 实时荧光定量PCR检测骨肉瘤癌组织及其癌旁组织中hsacirc0006602、Rac1 mRNA和miR-224的表达水平
3.1.1 提取骨肉瘤癌组织及其癌旁组织中总RNA
3.1.2 hsacirc0006602与Rac1的cDNA合成与qRT-PCR反应
3.1.3 miR-224的cDNA合成与qRT-PCR反应
3.2 细胞操作方法
3.2.1 细胞复苏
3.2.2 细胞培养条件
3.2.3 细胞传代
3.2.4 细胞冻存
3.3 测序鉴定hsacirc0006602在骨肉瘤细胞中存在
3.3.1 提取细胞中总RNA
3.3.2 逆转录为cDNA
3.3.3 人基因组DNA提取
3.3.4 PCR扩增
3.3.5 琼脂糖凝胶回收DNA片段
3.3.6 T载体连接
3.3.7 转化
3.3.8 蓝白斑筛选
3.4 实时定量PCR检测骨肉瘤细胞与正常成骨细胞中hsacirc0006602、Rac1 mRNA和miR-224的表达水平
3.4.1 提取细胞中总RNA
3.4.2 逆转录为cDNA
3.4.3 细胞的实时定量PCR反应
3.5 免疫印记检测Rac1在骨肉瘤癌组织及其癌旁组织中的表达
3.5.1 骨肉瘤组织总蛋白的提取
3.5.2 配置SDS-PAGE胶
3.5.3 免疫印迹实验步骤
3.6 免疫印记检测骨肉瘤细胞与hFOB1.19细胞中蛋白表达
3.6.1 细胞中总蛋白的提取
3.6.2 SDS-PAGE胶
3.6.3 免疫印记实验
3.7 MG63细胞转染
3.7.1 细胞的转染
3.7.2 实时定量PCR检测细胞转染效率
3.7.3 转染所用RNA序列
3.8 CCK-8检测细胞活性
3.9 Transwell实验检测细胞侵袭
3.10 检测细胞迁移(划痕实验)
3.11 生物信息学预测
3.12 双荧光素酶报告实验测定结合
3.12.1 提取基因组DNA
3.12.2 hsacirc0006602与Rac1野生型和突变型载体构建
3.12.3 双荧光素酶报告实验
3.13 hsacirc0006602 siRNA稳定转染细胞株获得与筛选
3.13.1 筛选浓度确定
3.13.2 hsacirc0006602 siRNA稳转株鉴定
3.14 裸鼠成瘤实验
3.15 统计学分析
4 实验结果
4.1 骨肉瘤中hsacirc0006602的筛选与结构鉴定
4.1.1 hsacirc0006602的环化过程
4.1.2 hsacirc0006602的结构鉴定
4.2 骨肉瘤及癌旁组织中hsacirc0006602、miR-224和Rac1的表达
4.3 骨肉瘤细胞系和正常人成骨细胞系hFOB1.19中hsacirc0006602、miR-224和Rac1的表达
4.4 敲低hsacirc0006602对MG63细胞中hsacirc0006602、miR-224、Rac1的表达及增殖、侵袭、迁移能力的影响
4.5 构建裸鼠移植瘤模型检测hsacirc0006602对骨肉瘤细胞皮下成瘤能力影响
4.6 生物信息学分析hsacirc0006602、miR-224和Rac1间关联
4.7 双荧光素酶报告实验检测hsacirc0006602、miR-224和Rac1间匹配结合作用
4.7.1 重组载体构建
4.7.2 双荧光素酶报告实验结果
4.8 转染miR-224 mimics可致MG63细胞中Rac1表达下调
4.9 回复实验验证在骨肉瘤细胞中存在hsacirc0006602/miR-224/Rac1网络调节骨肉瘤的增殖、侵袭和迁移
5 讨论
6 结论
7 参考文献
综述 circRNA的形成机制及与骨肉瘤的相关性研究进展
参考文献
个人简历
致谢
本文编号：3948781
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