骨髓基质细胞中平分型GlcNAc影响髓系恶性克隆细胞增殖的机制研究
发布时间：2024-05-12 21:15
造血干细胞可以产生所有谱系的血液细胞,它主要存在于骨髓内,骨髓壁龛可以为其提供静息、增殖和分化所必需的调节信号。骨髓基质细胞是骨髓的主要成分,越来越多的证据表明它是造血干细胞的“沉默伴侣”,可以分泌多种造血过程中所需的正负调控因子,发挥高效的调控作用,另一方面它也能为造血干细胞的增殖、分化与成熟构筑良好的空间环境。它还可以分泌生长因子以促进克隆细胞生存、招募内皮细胞及间充质干细胞。黑色素瘤细胞黏附分子(MCAM)被认为是骨髓壁龛的标志物,也是骨髓基质细胞命运的决策者。糖基化是存在较为广泛的蛋白翻译后修饰之一,与蛋白的表达、定位和半衰期密切相关,还影响细胞的增殖或凋亡等。糖链由糖基转移酶和糖苷酶共同作用产生。其中,N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III(MGAT3)负责将N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的β-1,4糖苷键连接到N-聚糖上的β-甘露糖上,形成平分型GlcNAc结构。平分型GlcNAc可以抑制细胞之间以及细胞与胞外基质之间的黏附从而抑制肿瘤转移,但其对于骨髓微环境以及其中的克隆细胞的影响尚未有深入研究。骨髓基质细胞与恶性克隆细胞共培养的模型,常被用于研究骨髓微环境中基质细胞与恶...
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语对照表
第一章 绪论
1.1 骨髓微环境
1.2 骨髓微环境中的黏附分子MCAM
1.3 糖基化修饰及平分型GlcNAc
1.4 蛋白糖基化位点鉴定
1.5 共培养模型及其应用
1.6 高尔基体、溶酶体与蛋白加工
1.7 立题根据与意义
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 细胞株与质粒
2.1.2 主要试剂
2.1.3 试剂及培养基的配制
2.1.4 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
2.2.2 细胞中蛋白质的提取
2.2.3 蛋白质免疫印迹
2.2.4 凝集素印迹
2.2.5 免疫共沉淀
2.2.6 酶联免疫吸附测定
2.2.7 细胞免疫荧光染色
2.2.8 Edu标记检测细胞增殖
2.2.9 平分型GlcNAc的检测
2.2.10 RNA提取
2.2.11 RT-PCR
2.2.12 细胞转染
2.2.13 蛋白在高尔基体及溶酶体中的定位检测
2.2.14 慢病毒浓缩
2.2.15 原代骨髓基质细胞转染
2.2.16 NHS-LC-Biotin生物素标记膜蛋白实验
2.2.17 小鼠骨髓基质细胞分离与培养
2.2.18 蛋白糖基化位点鉴定
2.2.19 统计学分析实验结果
第三章 结果与讨论
3.1 临床样本中MGAT3、MCAM以及平分型GlcNAc的表达
3.1.1 临床样本骨髓基质细胞中MGAT3、平分型GlcNAc以及MCAM的表达
3.1.2 MDS与对照组骨髓基质细胞中MGAT3和MCAM的 m RNA表达水平
3.1.3 小结
3.2 共培养后骨髓基质细胞中平分型GlcNAc修饰的变化
3.2.1 与恶性克隆细胞共培养后HS27a细胞中平分型GlcNAc表达的变化
3.2.2 与恶性克隆细胞共培养后HS5 细胞中平分型GlcNAc表达的变化
3.2.3 小结
3.3 基质细胞中修饰平分型GlcNAc对恶性克隆细胞增殖的影响
3.3.1 HS27a、HS27a-MGAT3 细胞对恶性克隆细胞增殖的影响
3.3.2 HS5、HS5-sh MGAT3 细胞对恶性克隆细胞增殖的影响
3.3.3 小结
3.4 HS27a与 HS27a-MGAT3 细胞中NF-κB信号通路、CAF相关marker以及细胞因子的检测
3.4.1 HS27a与 HS27a-MGAT3 细胞中NF-κB信号通路的检测
3.4.2 HS27a与 HS27a-MGAT3 细胞中CAF相关marker的检测
3.4.3 HS27a与 HS27a-MGAT3 条件培养基中细胞因子的检测
3.5 过表达MGAT3 及沉默MGAT3 细胞株的构建
3.5.1 HS27a-Tet One-MGAT3 细胞株的构建
3.5.2 MSC-MGAT3、MSC-sh MGAT3 细胞株的构建
3.5.3 小结
3.6 平分型GlcNAc影响MCAM表达的机制研究
3.6.1 平分型GlcNAc修饰MCAM
3.6.2 MCAM上N-糖基化修饰位点预测
3.6.3 MCAM蛋白上平分型GlcNAc位点的鉴定
3.6.4 生物素标记膜蛋白检测MCAM在膜内外的表达
3.6.5 免疫荧光染色检测HS27a和 HS27a-MGAT3中MCAM的表达
3.6.6 小结
3.7 小鼠模型验证基质细胞中过表达MGAT3对恶性克隆细胞增殖及生存期的影响
主要结论与展望
参考文献
攻读硕士学位期间取得的科研成果
致谢
本文编号：3971906
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语对照表
第一章 绪论
1.1 骨髓微环境
1.2 骨髓微环境中的黏附分子MCAM
1.3 糖基化修饰及平分型GlcNAc
1.4 蛋白糖基化位点鉴定
1.5 共培养模型及其应用
1.6 高尔基体、溶酶体与蛋白加工
1.7 立题根据与意义
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 细胞株与质粒
2.1.2 主要试剂
2.1.3 试剂及培养基的配制
2.1.4 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
2.2.2 细胞中蛋白质的提取
2.2.3 蛋白质免疫印迹
2.2.4 凝集素印迹
2.2.5 免疫共沉淀
2.2.6 酶联免疫吸附测定
2.2.7 细胞免疫荧光染色
2.2.8 Edu标记检测细胞增殖
2.2.9 平分型GlcNAc的检测
2.2.10 RNA提取
2.2.11 RT-PCR
2.2.12 细胞转染
2.2.13 蛋白在高尔基体及溶酶体中的定位检测
2.2.14 慢病毒浓缩
2.2.15 原代骨髓基质细胞转染
2.2.16 NHS-LC-Biotin生物素标记膜蛋白实验
2.2.17 小鼠骨髓基质细胞分离与培养
2.2.18 蛋白糖基化位点鉴定
2.2.19 统计学分析实验结果
第三章 结果与讨论
3.1 临床样本中MGAT3、MCAM以及平分型GlcNAc的表达
3.1.1 临床样本骨髓基质细胞中MGAT3、平分型GlcNAc以及MCAM的表达
3.1.2 MDS与对照组骨髓基质细胞中MGAT3和MCAM的 m RNA表达水平
3.1.3 小结
3.2 共培养后骨髓基质细胞中平分型GlcNAc修饰的变化
3.2.1 与恶性克隆细胞共培养后HS27a细胞中平分型GlcNAc表达的变化
3.2.2 与恶性克隆细胞共培养后HS5 细胞中平分型GlcNAc表达的变化
3.2.3 小结
3.3 基质细胞中修饰平分型GlcNAc对恶性克隆细胞增殖的影响
3.3.1 HS27a、HS27a-MGAT3 细胞对恶性克隆细胞增殖的影响
3.3.2 HS5、HS5-sh MGAT3 细胞对恶性克隆细胞增殖的影响
3.3.3 小结
3.4 HS27a与 HS27a-MGAT3 细胞中NF-κB信号通路、CAF相关marker以及细胞因子的检测
3.4.1 HS27a与 HS27a-MGAT3 细胞中NF-κB信号通路的检测
3.4.2 HS27a与 HS27a-MGAT3 细胞中CAF相关marker的检测
3.4.3 HS27a与 HS27a-MGAT3 条件培养基中细胞因子的检测
3.5 过表达MGAT3 及沉默MGAT3 细胞株的构建
3.5.1 HS27a-Tet One-MGAT3 细胞株的构建
3.5.2 MSC-MGAT3、MSC-sh MGAT3 细胞株的构建
3.5.3 小结
3.6 平分型GlcNAc影响MCAM表达的机制研究
3.6.1 平分型GlcNAc修饰MCAM
3.6.2 MCAM上N-糖基化修饰位点预测
3.6.3 MCAM蛋白上平分型GlcNAc位点的鉴定
3.6.4 生物素标记膜蛋白检测MCAM在膜内外的表达
3.6.5 免疫荧光染色检测HS27a和 HS27a-MGAT3中MCAM的表达
3.6.6 小结
3.7 小鼠模型验证基质细胞中过表达MGAT3对恶性克隆细胞增殖及生存期的影响
主要结论与展望
参考文献
攻读硕士学位期间取得的科研成果
致谢
本文编号：3971906
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