基于cell-SELEX技术的恶性黑色素瘤细胞高侵袭性适配体筛选

发布时间：2017-06-11 00:11

  本文关键词：基于cell-SELEX技术的恶性黑色素瘤细胞高侵袭性适配体筛选，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]核酸适配体(Aptamer)是一类能特异性识别靶分子的单链DNA或RNA,可利用人工构建的随机单链寡核苷酸文库,通过SELEX技术筛选获得。SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment,指数富集的配体系统进化)是一种全新的组合化学技术。核酸适配体具有无免疫原性、性质稳定、可体外合成、成本低、高特异性等特性。因而成为肿瘤生物标记物筛选及分子靶向治疗关注的焦点。恶性黑色素瘤是高死亡率的恶性肿瘤,云南地区高发。侵袭转移是黑色素瘤患者主要致死原因。本研究利用cell-SELEX技术,以高侵袭性黑色素瘤细胞A2058为靶细胞,以期筛选出侵袭性恶性黑色素瘤相关的特异性核酸适配体,为转移性恶性黑色素瘤分子诊断和靶向治疗提供新的候选靶标。[方法]本研究以人高侵袭性恶性黑色素瘤细胞株A2058作为靶细胞,人永生化上皮细胞Hacat为对照细胞,采用cell-SELEX技术,通过12轮筛选,富集特异性结合恶性黑色素瘤细胞A2058的特异性核酸适配体。同时利用流式细胞术,对筛得的次级文库进行流式检测,验证其与高侵袭性恶性黑色素瘤细胞A2058的特异性结合能力。最后,通过高通量测序,结合DNA MEN及oligoanalyzer软件预测核酸适配体序列的结构,在体外合成的次级文库中获取十条核酸适配体序列,再利用流式术验证其与A2058细胞的特异性结合能力。[结果]1.通过cell-SELEX平台富集适配体文库·通过PCR扩增优化退火温度,确定50℃为最佳退火温度根据引物Tm值,设定退火温度区间为50℃～65℃。根据目的条带的亮度、清晰度、弥散度及非特异性情况选取退火温度。通过RT-PCR凝胶电泳发现,在50℃退火温度下,目的条带亮度最大,条带无弥散且无明显非特异性条带。因此,确定50℃为PCR扩增最佳退火温度。·通过PCR扩增优化引物浓度,确定5uM为最佳引物浓度在相同的PCR反应体系下,设置不同引物浓度梯度：1μM,2uM,3uM, 4uM,5uM,6uM,7uM,8μM,9uM。根据目的条带的亮度、清晰度、弥散度及非特异性情况选取引物浓度。在5uM引物浓度下,目的条带亮度最大,条带无弥散且无明显非特异性条带。因此,确定5uM为PCR扩增最佳引物浓度。·优化筛选条件,富集最佳适配体文库通过调整筛选压力,提高筛选所得核酸适配体的特异性和亲和力,同时利用RT-PCR技术确定每轮筛选PCR扩增最佳循环数。在此条件下,经过12轮筛选,获得了针对人恶性黑色素瘤细胞A2058的富集文库,通过流式细胞术实验证实,筛选得到的次级文库可特异性识别恶性黑色素瘤细胞A2058,而对对照细胞Hacat无识别。2.高通量测序及核酸适配体的结构信息分析对第12轮ssDNA文库进行高通量测序,可见文库有良好富集。利用DNAMEN和oligoanalyzer软件对前20条序列进行结构信息分析,发现序列一级结构根据同源性可分四部分；二级结构以茎环结构为主。3.流式细胞术检测核酸适配体与细胞的结合情况经流式细胞术验证,获得3条可特异性识别人恶性黑色素瘤细胞A2058的核酸适配体序列：Seq7, Seq8, Seq10,研究发现,Seq7, Seq8, Seq10可特异性识别A2058细胞,但识别能力欠佳。[结论]通过cell-SELEX技术可筛选出特异性结合人恶性黑色素瘤细胞A2058的核酸适配体。Seq7, Seq8, Seq10可特异性识别人恶性黑色素瘤细胞A2058。
【关键词】：核酸适配体 Cell-SELEX技术 恶性黑色素瘤 转移
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-17
• 材料与方法17-29
• 结果29-44
• 讨论44-47
• 结论47-48
• 参考文献48-53
• 综述53-62
• 参考文献58-62
• 攻读学位期间获得的学术成果62-63
• 致谢63-64

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 梁红茹;杨松涛;张涛;胡桂秋;夏咸柱;;核酸适配体及其在病原微生物学中的应用[J];生物工程学报;2011年05期

2 姚远;张波;;核酸适配体及其应用研究进展[J];国际检验医学杂志;2014年08期

3 甘龙杰;兰小鹏;;适配体芯片技术及其应用[J];临床检验杂志;2009年06期

4 兰小鹏;;适配体技术及其在医学检验研究中的作用[J];临床检验杂志;2012年10期

5 李晓佩;杨良嵘;黄昆;李文松;孙西同;刘会洲;;核酸适配体在生化分离及检测领域中的研究进展[J];化工学报;2013年01期

6 刘婷先;张娜;;适配体在肿瘤治疗方面的应用[J];生命的化学;2013年05期

7 唐德平;张宇洁;毛爱红;;适配体在体外细胞检测中的应用[J];重庆医学;2014年13期

8 李红玉;阎辉;;适配体与病毒性感染诊断及治疗[J];中国生物化学与分子生物学报;2013年05期

9 满燕;吕雪飞;彭广;宋达;庆宏;;双适配体夹心微阵列芯片在凝血酶检测中的应用[J];生命科学仪器;2014年Z1期

10 胡燕;杨先达;;核酸适配体在肿瘤学中的应用研究进展[J];基础医学与临床;2012年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 蔡圣;刘彩云;卢建忠;;基于核酸适配体和酶循环放大的腺苷化学发光检测[A];中国化学会第十届全国发光分析学术研讨会论文集[C];2011年

2 陈巍;赵新颖;屈锋;;毛细管电泳法筛选蛋白质的核酸适配体的初步研究[A];全国生物医药色谱学术交流会（2010景德镇）论文集[C];2010年

3 杨晓娟;邴涛;梅宏成;上官棣华;;核酸适配体用于手性拆分L型和D型色氨酸[A];全国生物医药色谱学术交流会（2010景德镇）论文集[C];2010年

4 郑冬梅;娄新徽;;一种基于结构开关型适配体的无标记荧光传感法[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年

5 薛利云;周小明;邢达;;基于核酸适配体探针和酶辅助荧光信号扩增的等温高灵敏度蛋白检测方法[A];中国光学学会2011年学术大会摘要集[C];2011年

6 马文韬;古力;屈锋;;毛细管电泳筛选大肠杆菌适配体的初步研究[A];全国生物医药色谱学术交流会（2010景德镇）论文集[C];2010年

7 梁好均;徐华国;邓伟;;核酸适配体链构象转变的研究[A];2014年两岸三地高分子液晶态与超分子有序结构学术研讨会摘要集[C];2014年

8 王晓芳;程琳;耿霞;赵强;;基于适配体修饰的磁珠和量子点荧光法检测凝血酶[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年

9 汪海林;章大鹏;;单核苷水平核酸适配体与蛋白质相互作用分析[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年

10 温桂清;范燕燕;梁爱惠;蒋治良;;核酸适配体纳米金共振散射光谱检测血清中钾离子[A];中国化学会第十五届全国有机分析及生物分析学术研讨会论文集[C];2009年

中国重要报纸全文数据库 前2条

1 潘文;核酸适配体在医药领域应用前景广阔[N];中国医药报;2010年

2 于洋　田野;蛋白质检测有了新方法[N];吉林日报;2011年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 黄玉坤;基于核酸适配体识别-时间分辨荧光纳米探针的生物毒素检测方法研究[D];江南大学;2015年

2 陈霞;功能核酸的筛选及在分析检测中的应用[D];武汉大学;2012年

3 林雪霞;微流控芯片与可控适配体技术用于细胞代谢物分析及其相互作用的研究[D];北京化工大学;2015年

4 周庆同;生物相空间中的适配体和药物虚拟筛选[D];中国科学技术大学;2015年

5 郭业民;基于适配体传感器的牛奶中抗生素残留快速检测技术研究[D];东北农业大学;2015年

6 李菁菁;适配体功能化的荧光纳米探针用于蛋白和细胞传感研究[D];南京大学;2012年

7 于鸽;乙丙肝病毒相互干扰及适配体在肝癌诊断及靶向治疗中的作用[D];吉林大学;2016年

8 王成全;基于磁控适配体传感体系的农产品中典型霉菌毒素检测研究[D];江苏大学;2016年

9 姜红岩;自组装RNA适配体纳米传感器[D];北京协和医学院;2016年

10 胡波;海洋聚醚类毒素基于适配体的检测及生物合成的探索[D];第二军医大学;2016年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 张月侠;蛋白质寡核苷酸适配体的筛选与应用研究[D];山东师范大学;2009年

2 刘金钏;适配体纳米金比色法灵敏度影响因素研究及其在食品安全检测中的应用[D];中国农业科学院;2015年

3 吕琴;基于荧光标记适配体的荧光各向异性法检测小分子[D];山西大学;2015年

4 高婕;基于适配体的酶分子检测新方法[D];山西大学;2014年

5 吕珍珍;基于核酸适配体的非标记荧光检测方法研究[D];四川农业大学;2014年

6 古乐;基于多适配体和荧光共振能量转移技术的蛋白质检测方法研究[D];北京理工大学;2016年

7 秦静;基于核酸适配体与氧化石墨烯的荧光传感器对奶制品中β-内酰胺酶的检测研究[D];广东工业大学;2016年

8 许景月;非标记核酸适配体传感器检测动物源性食品中四环素和多巴胺残留[D];吉林大学;2016年

9 李莹;双酚A和17β-雌二醇的纳米荧光核酸适配体传感器的构建与应用研究[D];吉林大学;2016年

10 郑宏儒;核酸适配体光学传感器检测三聚氰胺的研究与应用[D];吉林大学;2016年

  本文关键词：基于cell-SELEX技术的恶性黑色素瘤细胞高侵袭性适配体筛选，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：440354