miR-192靶向TCF7基因对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用

发布时间：2017-06-17 05:11

  本文关键词：miR-192靶向TCF7基因对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的抑制作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景骨肉瘤(osteosarcoma)是较常见的恶性骨肿瘤,主要影响儿童和青少年。骨肉瘤具有较强的迁移能力,导致许多患者死于肺转移。虽然人们在骨肉瘤的治疗上投入很多精力,但患者五年生存率仍仅达60%-70%。目前,人们的研究主要集中在后基因组方面,因此,从基因水平上探讨骨肉瘤发生发展的分子机制,寻找新的诊断和防治方法显得尤为重要。Micro RNA(mi RNA)是一类保守的内源性非编码小RNA,通过转录和转录后水平调控基因的表达。mi RNA参与许多生物过程,如细胞的增殖、血管生成、细胞代谢等,其异常表达与肿瘤的发生及进展密切相关。最新研究报道,mi R-192在多种肿瘤细胞中低表达,如肺癌、直肠癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和骨肉瘤。然而,关于mi R-192对骨肉瘤细胞生物学行为的影响尚未见报道。因此,探讨mi R-192对人骨肉瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭迁移的影响,揭示其相关的作用机制,将为骨肉瘤的临床防治提供新的思路和策略研究目的本实验通过骨肉瘤患者组织标本,检测骨肉瘤组织及其癌旁组织中mi R-192及TCF7基因表达差异。采用骨肉瘤U-2OS和MG63细胞,观察转染mi R-192对骨肉瘤增殖、凋亡及侵袭迁移的影响,并初步探索mi R-192的生物靶标及其调控机制,为mi RNA在骨肉瘤的防治的作用提供实验依据和新靶点。方法1.在郑州大学第一附属医院(2013年6月至2015年3月期间)收集20例骨肉瘤患者癌组织及其癌旁组织标本,-80°C保存。使用荧光实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)方法检测20例骨肉瘤组织及其癌旁组织标本中mi R-192及TCF7基因m RNA的表达水平,并分析二者之间的关系。同时采用免疫印迹法(Western blot)检测TCF7蛋白的表达水平。2.采用RT-q PCR方法检测成骨细胞h FOB1.19,骨肉瘤细胞U-2OS和MG63中mi R-192及TCF7基因的m RNA表达水平。3.合成mi R-192 agomir和mi R-192 negative control,并采用脂质体转染法将其分别转入骨肉瘤细胞U-2OS和MG63中。实验分组如下:(1)mi R-192组:转染mi R-192 agomir。(2)NC组:转染mi R-192 negative control。(3)Blank组:仅转染试剂脂质体。4.CCK-8法检测细胞生长实验和集落形成实验,观察mi R-192对骨肉瘤细胞增殖的影响。5.流式细胞术和Caspase酶活性实验,观察mi R-192对骨肉瘤细胞凋亡的影响。6.细胞划痕实验,观察mi R-192对骨肉瘤细胞迁移能力的影响。7.Transwell实验,观察mi R-192对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。8.采用Pic Tar、mi Rwalk、Target Scan和mi Randa等生物信息学软件预测mi R-192的作用靶标。同时构建含有TCF7的3’-UTR区的野生型和突变型的重组双荧光素酶报告基因载体,分别将其与mi R-192 agomir或mi R-192 negative control一起共转染入骨肉瘤细胞U-2OS和MG63中,并运用Western blot实验方法和双荧光素酶报告实验证实TCF7是mi R-192的作用靶标。9.Western blot检测各组细胞转染mi R-192 agomir后,骨肉瘤细胞U-2OS及MG63中细胞周期蛋白C yclin D1,凋亡抑制蛋白Survivin和与侵袭迁移相关的蛋白Snail的表达。结果1.与癌旁组织相比,骨肉瘤组织中,mi R-192的表达明显降低(P0.01),TCF7m RNA的水平明显升高(P0.01),并且mi R-192的表达与TCF7 m RNA的水平呈负相关。此外,骨肉瘤组织中TCF7的蛋白表达也高于癌旁组织。2.骨肉瘤细胞U-2OS和MG63中,mi R-192的表达明显低于成骨细胞h FOB1.19(P0.01),TCF7 m RNA表达明显高于成骨细胞h FOB1.19(P0.01)。3.转染mi R-192 agomir后,mi R-192转染组的mi R-192表达水平显著高于NC组和Blank组,其差异具有统计学意义(P0.01)。表明骨肉瘤细胞转染mi R-192后,骨肉瘤细胞的mi R-192表达水平明显上调。4.CCK-8(Cell Counting K it)生长实验和集落形成结果显示,与NC组和Blank组比较,mi R-192组的骨肉瘤细胞在OD450处的吸光度值明显下降,集落形成数目也明显减少,差异具有统计学意义(P0.05),而NC组和Blank组间比较骨肉瘤细胞的吸光度和集落形成数目无显著性差异(P0.05)。5.流式细胞术检测细胞凋亡实验和Caspase-3酶活性检测实验结果显示,与NC组和Blank组比较,mi R-192组骨肉瘤细胞的细胞凋亡率和Caspase-3酶活性均明显升高,其差异具有统计学意义(P0.01),而NC组和Blank组间比较骨肉瘤细胞的凋亡数和Caspase-3活性无显著性差异(P0.05)。6.Transwell实验结果显示,与NC组和Blank组相比较,mi R-192组的骨肉瘤细胞穿过基底膜的细胞数明显减少,其差异具有统计学意义(P0.05),而NC组和Blank组间比较穿过基底膜的骨肉瘤细胞数无显著性差异(P0.05)。7.划痕实验结果提示,与NC组和Blank组比较,mi R-192组细胞的迁移能力明显降低,而NC组和Blank组间比较细胞的迁移能力无显著性差异。8.Western blot和双荧光素酶报告实验结果提示,TCF7是mi R-192的作用靶标。9.Western blot结果提示,转染mi R-192 agomir后,与NC组和Blank组比较,mi R-192组中,细胞周期蛋白Cyclin D1,凋亡抑制蛋白Survivin与侵袭迁移相关的蛋白Snail的表达均下降,而NC组与Blank组比较,细胞中Cyclin D1,Survivin和Snail蛋白的表达无差异。结论1.骨肉瘤组织和细胞中,mi R-192异常低表达,TCF7高表达,二者呈现负相关。2.mi R-192通过作用于TCF7的3’-UTR区负向调控其表达,并抑制其下游相关基因Cyclin D1,Survivin和Snail的表达,从而发挥生物学作用。3.上调骨肉瘤细胞中mi R-192的表达能够有效抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移,并促进骨肉瘤细胞的凋亡。
【关键词】：miR-192 TCF7 骨肉瘤 增殖 侵袭
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.1
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 1 引言13-15
• 2 材料和方法15-33
• 2.1 材料15-21
• 2.1.1 研究对象15
• 2.1.2 细胞系来源15
• 2.1.3 质粒15-17
• 2.1.4 引物17
• 2.1.5 主要试剂17-18
• 2.1.6 主要仪器设备18-19
• 2.1.7 常用试剂配制19-21
• 2.2 实验方法21-33
• 2.2.1 标本中miR-192的表达检测21-22
• 2.2.2 标本中TCF7的表达检测22-24
• 2.2.3 检测细胞中miR-192和TCF7 mRNA的表达24-25
• 2.2.4 将miR-192转染入骨肉瘤细胞U-2OS和MG6325
• 2.2.5 转染效果检测25
• 2.2.6 细胞增殖实验25-26
• 2.2.7 细胞凋亡实验26-27
• 2.2.8 细胞侵袭实验27-28
• 2.2.9 细胞划痕实验28
• 2.2.10 靶基因预测28
• 2.2.11 Western blot实验检测TCF7蛋白的表达28
• 2.2.12 双荧光素酶报告实验28-32
• 2.2.13 Western blot实验检测TCF7、CyclinD1、Snail和Survivin蛋白表达32
• 2.2.14 统计学分析32-33
• 3 实验结果33-43
• 3.1 骨肉瘤组织中miR-192和TCF7的表达及相关性33-34
• 3.2 正常成骨细胞和骨肉瘤细胞中miR-192与TCF7 mRNA的表达34
• 3.3 骨肉瘤细胞的转染效果检测34
• 3.4 miR-192对骨肉瘤细胞增殖的影响34-35
• 3.5 miR-192对骨肉瘤细胞凋亡的影响35-37
• 3.6 miR-192对骨肉瘤细胞侵袭的影响37-38
• 3.7 miR-192对骨肉瘤细胞迁移能力的影响38
• 3.8 miR-192靶基因的预测38-39
• 3.9 Western blot验证miR-192的靶基因39
• 3.10 双荧光素酶报告实验验证miR-192的靶点39-42
• 3.10.1 Pmir-Glo-TCF7重组报告基因载体的构建39-41
• 3.10.2 双荧光素酶报告实验结果41-42
• 3.11 Western blot检测TCF7、CyclinD1、Survivin和Snail的表达42-43
• 4 讨论43-45
• 5 结论45-46
• 6 参考文献46-49
• 综述49-59
• 参考文献59
• 参考文献59-63
• 中英文缩略词表63-64
• 个人简历64-65
• 致谢65

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