蜂毒肽与基因变构IL-2融合蛋白在肿瘤细胞中的表达及生物学活性研究

发布时间：2017-06-26 15:23

  本文关键词：蜂毒肽与基因变构IL-2融合蛋白在肿瘤细胞中的表达及生物学活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的构建融合基因蜂毒肽(melittin)与人变构白介素-2[M-IL-2(88Arg,125Ala)]表达载体,验证构建成功后将重组基因转染进宫颈癌He La细胞,神经胶质瘤U87细胞,检测融合基因[M-IL-2(88Arg,125Ala)]在这两种细胞中的表达以及检测重组蛋白对宫颈癌He La细胞,神经胶质瘤U87细胞的影响,为蜂毒肽和白介素2在肿瘤方面的基因治疗提供实验基础。方法设计PCR扩增引物,并在引物上添加相应的酶切位点,以p PICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala)为模板,使用PCR方法,获得实验所需要的M-IL-2目的片段。以p LEGFP-C1和p EGFP-N3为载体构建M-IL-2融合基因的真核表达载体p LEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),p EGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)。使用质粒提取试剂盒提取重组质粒,采用双酶切和DNA序列的方法鉴定重组质粒,鉴定成功后,使用Lipofectamine 2000脂质体将重组质粒转染进宫颈癌He La细胞和神经胶质瘤细胞U87中。M-IL-2融合蛋白在宫颈癌He La细胞和神经胶质瘤U87细胞中的表达采用RT-PCR及Western blot的方法进行检测,表达验证成功后使用CCK-8的方法及流式细胞仪检测融合蛋白的生活学活性,检测其对宫颈癌He La细胞和神经胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响。结果重组质粒p LEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),p EGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)经过酶切及DNA测序证实构建成功,经过RT-PCR及Western blot检测证实重组基因M-IL-2(88Arg,125Ala)可在宫颈癌细胞He La,神经胶质瘤细胞U87中表达,经过CCK-8实验及细胞流式仪分析融合蛋白在细胞内的表达对以上两种肿瘤细胞的增殖具有一定的抑制作用。结论真核表达载体pLEGFP-C1-M-IL-2(88Arg,125Ala),pEGFP-N3-M-IL-2(88Arg,125Ala)构建成功,融合基因M-IL-2(88Arg,125Ala)可在He La细胞和U87细胞中表达且融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)对宫颈癌细胞He La,神经胶质瘤细胞U87增殖具有一定的抑制作用,对Hela细胞的凋亡具有一定的促进作用,为融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)的进一步研究提供了实验基础。
【关键词】：白介素2 蜂毒肽 融合蛋白 真核表达 生物活性
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3
【目录】：

• 摘要2-3
• abstract3-6
• 引言6-8
• 第一章 材料与仪器8-13
• 1.1 细胞培养及细胞培养8
• 1.2 质粒和菌株8
• 1.3 主要实验试剂及配制方法8-11
• 1.3.1 主要实验试剂8-9
• 1.3.2 主要试剂配制方法9-11
• 1.4 实验仪器和设备11-13
• 第二章 实验方法13-29
• 2.1 重组质粒的构建13-17
• 2.1.1 引物设计与合成14-16
• 2.1.2 目的基因扩增及载体构建16-17
• 2.2 重组质粒扩增17-18
• 2.2.1 重组质粒转化大肠杆菌DH5α17-18
• 2.2.2 菌株的保存18
• 2.3 细胞培养18-20
• 2.3.1 细胞复苏18-19
• 2.3.2 细胞传代19
• 2.3.3 细胞冻存19-20
• 2.4 肿瘤细胞转染及转化效率优化20-21
• 2.4.1 肿瘤细胞转染20-21
• 2.4.2 转化效率优化21
• 2.5 检测融合基因M-IL-2(88Arg, 125Ala)在mRNA水平的表达21-24
• 2.5.1 细胞总RNA的提取21-22
• 2.5.2 RT-PCR检测外源基因M-IL-2(88Arg, 125Ala)在mRNA水平的表达22-24
• 2.6 细胞总蛋白的提取、检测24-27
• 2.6.1 细胞总蛋白的提取24
• 2.6.2 Western-blot检测目的蛋白24-27
• 2.7 融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)的表达对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响27-28
• 2.7.1 CKK-8 检测融合蛋白表达对肿瘤细胞Hela、U87增殖的影响27-28
• 2.7.2 TUNEL法检测融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala) 表达对肿瘤细胞Hela凋亡的影响28
• 2.8 统计学分析28-29
• 第三章 结果29-42
• 3.1 重组质粒的构建及鉴定29-32
• 3.1.1 提取重组质粒pPICZαA/M-IL-2(88Arg, 125Ala)并鉴定29-31
• 3.1.2 重组质粒构建及鉴定31-32
• 3.2 细胞培养32-34
• 3.3. 融合蛋白M-IL-2(88Arg, 125Ala)在肿瘤细胞中的表达34-38
• 3.3.1 细胞转染34-36
• 3.3.2 RT-PCR检测M-IL-2(88Arg,125Ala)在Hela及U87细胞中m RNA的转录36-37
• 3.3.3 Western blot检测M-IL-2(88Arg, 125Ala)在Hela及U87细胞中的表达37-38
• 3.4 CKK-8、TUNEL法检测融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响38-42
• 3.4.1 CKK-8 检测融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)对肿瘤细胞增殖的影响38-40
• 3.4.2 TUNEL检测融合蛋白表达对肿瘤细胞凋亡的影响40-42
• 第四章 讨论42-43
• 第五章 结论43-44
• 参考文献44-47
• 文献综述47-55
• 参考文献53-55
• 攻读学位期间研究成果55-56
• 致谢56-57

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王松;苗利光;李海涛;刘艳环;王文昊;安亚雄;冯卓;;重组hIL-2表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达[J];特产研究;2012年01期

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 侯伟;26肽蜂毒素与基因变构人白细胞介素2嵌合蛋白的原核表达、纯化及活性测定[D];青岛大学;2004年

2 刘明军;蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白的纯化工艺探索和生物学活性研究[D];青岛大学;2007年

3 董军奎;重组蜂毒素-IL2体外活化免疫细胞及杀伤肿瘤细胞的活性研究[D];青岛大学;2008年

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本文编号：486674