创伤治愈微环境抑肺癌机制与药物治疗

发布时间：2017-06-27 16:07

  本文关键词：创伤治愈微环境抑肺癌机制与药物治疗，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肿瘤的发生发展与肿瘤微环境密切相关,肿瘤被称为永不愈合的创伤。创伤修复过程与肿瘤发生发展过程在信号传导方面有很多相同之处,创伤修复一直被认为是促癌因素之一。然而,创伤治愈是组织器官恢复功能的必要条件,是否治愈创伤能够阻止肿瘤发展未有报道。基于中医“创伤治愈需元气充足”的观点,我们提出“创伤治愈微环境可以阻止癌症的发生”。为验证此科学假设的正确性,我们开展了创伤治愈微环境抑肺癌机制与药物治疗研究。本课题首先用小鼠全层皮肤切除创伤模型筛选出有创伤愈合作用的药物,通过血流灌注量、小鼠耳肿胀抗炎模型、巨噬细胞的吞噬作用观察药物治疗创伤的特点,根据药物作用特点进行创伤愈合药物组合。接着,我们用创伤愈合药物组合体外处理A549、BEAS-2B和L929细胞,MTT法检测细胞增殖;划痕标记染料示踪法观察细胞连接通讯功能;软琼脂克隆实验和细胞成球实验检测细胞自我更新能力。最后,我们采用乌拉坦诱导小鼠肺癌模型观察创伤愈合药物组合营造的创伤治愈微环境对小鼠肺癌发展的影响,体重和自主活动检测考察药物组合对小鼠正常生理的影响;肺部病理变化、肺癌发生率及肺肿瘤结节数检测药物组合对肿瘤发生的影响;免疫组化检测细胞增殖标记物ki67及凋亡相关标志物cleaved caspase-3;Western blot检测肿瘤干细胞标志物Oct4及Nanog,细胞通讯标志物细胞间隙连接蛋白Connexin43,上皮-间充质转化标志物E-钙粘蛋白,N-钙粘蛋白及波形蛋白。另外,为了进一步探索创伤治愈微环境抑制肿瘤发展的机制,我们在乌拉坦诱导小鼠肺癌模型中用脂多糖气管滴注,氯屈膦酸钠脂质体腹腔注射,博来霉素气管滴注观察了肺炎症、肺巨噬细胞耗竭和肺损伤对肺癌发展及药物组合的影响,重点用ELISA试剂盒检测细胞炎症标志物肿瘤坏死因子α(TNFα)、髓过氧化物酶(MPO),和细胞损伤标志物活性氧(ROS)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)。实验结果表明,在筛选的药物中,乌头碱,紫草素和三七皂苷R1较快的促进了小鼠全层皮肤切除创伤愈合;三七皂苷R1及乌头碱在激光散斑仪检测中增加了创伤局部的血流灌注量;仅紫草素对TPA引起的小鼠耳肿胀有显著的抑制作用;而三七皂苷R1及乌头碱在巨噬细胞吞噬实验表现了吞噬能力增强作用。因此,我们将三个药物组合成创伤治愈复合物营造创伤治愈微环境用于体内外观察创伤治愈微环境对肿瘤发展的影响。在体外实验中,0.2μM~1μM紫草素能抑制ECV304细胞增殖;2μM~10μM三七皂苷R1抑制L929细胞增殖而促进了ECV304的增殖,0.02μM~0.1μM乌头碱促进了L929的增殖,而三个药物组合促进了L929细胞和ECV304细胞的增殖而并不抑制A549增殖。药物组合恢复了乌拉坦导致的BEAS-2B细胞间连接通讯减少,减少了A549肿瘤细胞的软琼脂克隆和干细胞成球数量。在乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型中,0.2mg/kg乌头碱,2mg/kg紫草素,20mg/kg三七皂苷R1对乌拉坦化学诱导小鼠肺癌模型肺癌的预防率分别为50%,30%及35%,药物组合预防率可高达90%。病理结果显示三个药物单独使用虽然均能一定程度改善致癌小鼠肺组织病理变化,三者联合用药可使致癌小鼠肺组织病理变化恢复到接近正常。免疫组化结果显示药物组合能显著下调ki67和上调Cleaved Caspase-3的表达。Western实验结果显示,药物组合可以下调干细胞标志物Oct4,Nanog的表达,增加连接蛋白Connexin43,E-钙粘蛋白表达,减少N-钙粘蛋白,波形蛋白表达。另外,我们发现脂多糖气管滴注主要增加肺脏中MPO及TNFα,对小鼠肺癌并无明显促进作用;博来霉素气管滴注以增加肺脏中ROS和8-OHdG为主,同时促进了肺癌发生;而氯屈磷酸钠脂质体在致癌前耗竭巨噬细胞表现出降低MPO及TNFα的抗炎作用和增加ROS及8-OHdG的促肺损伤作用,也促进肺癌发生。值得注意的是,在三种处理方式下,药物组合物营造的损伤治愈微环境肺癌防治作用均降低。综上所述,创伤治愈微环境能够阻止肺癌的发生和发展,创伤治愈药物组合可能是一种防治肺癌和有前景的方法。
【关键词】：创伤治愈微环境 肺癌预防 创伤治愈药物组合 肿瘤干细胞
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• ABBREVIATION13-14
• 第一章 绪论14-18
• 第二章 促进创伤治愈药物的筛选18-26
• 2.1 前言18
• 2.2 实验材料18-19
• 2.2.1 药物及其试剂18
• 2.2.2 实验动物18-19
• 2.2.3 主要仪器设备19
• 2.3 实验方法19-20
• 2.3.1 药物对小鼠皮肤创伤模型的影响19
• 2.3.2 激光散斑观察筛选的药物对创伤部位血流灌注量的影响19
• 2.3.3 筛选的药物对小鼠耳肿胀模型的影响19-20
• 2.3.4 筛选的药物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响20
• 2.3.5 统计学分析20
• 2.4 实验结果20-24
• 2.4.1 药物对小鼠皮肤创伤模型的影响20-22
• 2.4.2 筛选的药物对血流灌注量的影响22
• 2.4.3 筛选的药物对小鼠耳肿胀模型的影响22-23
• 2.4.4 筛选的药物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响23-24
• 2.5 实验小结24-26
• 第三章 体外创伤治愈微环境抑肺癌作用研究26-34
• 3.1 前言26
• 3.2 实验材料26-28
• 3.2.1 试剂材料26
• 3.2.2 实验细胞26-27
• 3.2.3 实验仪器27
• 3.2.4 试剂配制27-28
• 3.3 实验方法28-29
• 3.3.1 MTT细胞增殖实验28
• 3.3.2 划痕标记染料示踪方法检测细胞间隙连接通讯28-29
• 3.3.5 软琼脂克隆实验29
• 3.3.6 肿瘤干细胞成球实验29
• 3.3.7 统计学分析29
• 3.4 实验结果29-33
• 3.4.1 MTT检测药物对细胞增殖的影响29-30
• 3.4.2 药物对细胞间连接通讯的影响30
• 3.4.3 药物对A549软琼脂克隆实验的影响30-31
• 3.4.5 药物对A549干细胞成球实验的影响31-33
• 3.5 实验小结33-34
• 第四章 体内创伤治愈微环境抑肺癌作用研究34-50
• 4.1 前言34
• 4.2 实验材料34-37
• 4.2.1 实验药品及试剂34-35
• 4.2.2 实验动物35
• 4.2.3 实验仪器35
• 4.2.4 试剂配制35-37
• 4.3 实验方法37-41
• 4.3.1 筛选药物对化学诱导小鼠肺癌模型的预防作用37
• 4.3.2 肺组织HE染色37-38
• 4.3.3 免疫组化检测肺组织KI67及CLEAVED CASPASE-338-39
• 4.3.4 免疫印迹检测肺组织中蛋白表达39-41
• 4.3.5 统计学分析41
• 4.4 实验结果41-48
• 4.4.1 药物对小鼠体重变化的影响41-42
• 4.4.2 药物对小鼠自主活动的影响42
• 4.4.3 药物对乌拉坦诱导肺癌发生率的影响42-43
• 4.4.4 药物对肺屏障通透性检测43-44
• 4.4.5 肺脏病理学诊断44-45
• 4.4.6 KI67及CLEAVED CASPASE-3 免疫组化表达45-46
• 4.4.7 免疫印迹检测肺组织中蛋白表达46-48
• 4.5 实验小结48-50
• 第五章 创伤治愈微环境抑肺癌作用机制研究50-58
• 5.1 前言50
• 5.2 实验材料50-51
• 5.2.1 试剂材料50
• 5.2.2 实验动物50-51
• 5.2.3 实验仪器51
• 5.2.4 检测试剂盒51
• 5.3 实验方法51-52
• 5.3.1 药物对不同模型组肺脏的影响51
• 5.3.2 炎症与损伤相关细胞因子的检测51
• 5.3.3 创伤修复能力的检测51-52
• 5.3.4 统计方法52
• 5.4 实验结果52-57
• 5.4.1 药物对不同模型组肺脏的影响52-54
• 5.4.2 不同造模方法对肺脏细胞因子的影响54-55
• 5.4.3 药物对乌拉坦诱导肺癌模型肺脏细胞因子的影响55
• 5.4.4 药物对乌拉坦诱导肺癌模型联合巨噬细胞耗竭肺脏细胞因子的影响55-56
• 5.4.5 药物对乌拉坦诱导肺癌模型小鼠皮肤创伤的影响56-57
• 5.5 实验小结57-58
• 第六章 讨论58-60
• 第七章 结论60-62
• 第八章 创新性总结62-64
• 参考文献64-70
• 致谢70-71
• 攻读学位期间发表的学术论文71-72

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