ANG通过HMGA2调控肺鳞状细胞癌细胞迁移、侵袭功能机制研究

发布时间：2017-06-29 12:15

  本文关键词：ANG通过HMGA2调控肺鳞状细胞癌细胞迁移、侵袭功能机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:作为一种恶性肿瘤,肺癌在全球范围内的死亡率高居第一,虽然近年来针对其的诊治方法已取得了长足的进展,但是其预后仍不甚理想。而降低肺癌细胞细胞的侵袭及转移能力仍是降低肺癌发病率及致死率的重要一环。而肺鳞癌作为肺癌的第二大病理分型,占全部病理分型的40%。血管生成素(ANG)作为血管核糖核酸酶RNase A家族的一员,在多种肿瘤细胞中高表达,它具有33%的氨基酸成分及56%的RNase-A同源性。ANG被认为在肿瘤血管生成的过程中起着关键的作用。而近些年的研究发现,ANG可以直接刺激rRNA的转录从而促进细胞的增殖,并与肿瘤的预后不良具有一定的相关性。ANG还可以裂解tRNA来影响肿瘤细胞中的各种反应,包括细胞的增殖、浸润以及细胞核中管道的形成等,而在正常的非内皮细胞的细胞核中,ANG却鲜有表达。高迁移率族蛋白-2(HMGA2)被报道参与了多种生物学发展过程,包括胚胎的形成及肿瘤的发展。因为它可以通过改变染色质的结构来调节多种靶基因的表达,HMGA2常被称为是”建筑转录因子”。他被报道与多种恶性肿瘤的不良预后具有相关性。基于此,本研究拟探究ANG-HMGA2通路对肺鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,并探讨其可能的作用机制。并为今后ANG介导的相关靶向治疗提供科学的依据。方法:本研究分为以下三个部分:1、检测肺鳞癌组织和正常癌旁组织中ANG和HMGA的表达:收集肺鳞癌患者的肿瘤病灶组织与患者癌旁正常的肺组织,利用RT-PCR、Western Blot及免疫组织化学实验技术在mRNA及蛋白水平检测ANG及HMGA2在正常肺组织与肺鳞癌组织中的表达有无差异,利用免疫组织化学染色实验对比正常癌旁肺组织标本和肺鳞癌肿瘤组织标本中ANG及HMGA2表达情况。2、ANG及HMGA2在肺鳞癌细胞中表达的关联性及对肺鳞癌细胞功能的影响:培养人肺鳞癌细胞株SK-MES-1,并构建包有ANG及干扰ANG的RNA腺病毒。用Ad-ANG及ShHMGA2转染细胞株SK-MES-1,以Ad-GFP及shScramble作为转染对照,采用RT-PCR及Western Blot技术分别对比过表达及沉默ANG后HMGA2的表达差异。对比过表达及沉默HMGA2后SK-MES-1的增殖、迁移及侵袭等功能学改变。3、ANG直接调控HMGA2表达的机制研究:培养培养人肺鳞癌细胞株SK-MES-1,构建Ad-ANG及shHMGA2,转染SK-MES-1,以同种细胞株转染Ad-GFP及shScramble作对照,验证过表达ANG但沉默HMGA2后两组细胞间迁移、侵袭及增殖等功能的差异。然后采用染色体免疫共沉淀方法(CHIP)技术验证HMGA2是否结合在ANG启动子区。结果:1、通过qPCR在12对肺鳞癌及癌旁组织对ANG和HMGA2进行mRNA层面的检测,我们得出肺鳞癌组织中的ANG及HMGA2的mRNA表达相对于对照组明显升高(P0.05),同样的趋势也出现在Western Blot及免疫组化中。2、在细胞层面上,我们对肺鳞癌细胞系SK-MES-1转染了包有ANG的腺病毒,分别在mRNA水平及Western Blot水平验证转染效率后,随后利用RT-PCR检测实验和对照组的ANG及HMGA2的mRNA的量,结果示,实验组HMGA2mRNA表达水平高于对照组(P0.05)。而肺鳞状细胞癌细胞系SK-MES-1中转染Ad-ANG后行Transwell迁移及侵袭试验后迁移及侵袭细胞数经高倍显微镜计数后与对照组相比具有显著增多(*P0.05)。而转染后的细胞系在CCK8增殖实验在450nm处的OD值与对照组相比其具有显著差异(*P0.05)。3、在共转染Ad-ANG及shHMGA2后,经PCR和Western Blot实验检测,HMGA2在mRNA和蛋白层面的表达相对于对照组差异明显。Transwell迁移及侵袭试验结果示在HMGA2干扰组中,高倍镜下观察,透膜迁移及侵袭的细胞明显减少。CCK8细胞增殖试验示HMGA2干扰组的细胞相对于对照组在OD450的吸光值明显降低。接下来,染色体免疫共沉淀结果示ANG确实与HMGA2启动子序列有结合。结论:ANG及其潜在下游调控蛋白HMGA2在肺鳞状细胞癌组织中高表达,过表达了ANG后,HMGA2在mRNA层面及蛋白层面均显著提高,且细胞的增殖、迁移及侵袭能力均有显著提高。同样过表达ANG,HMGA2抑制组细胞的增殖、迁移及增殖功能明显降低,这进一步证实了ANG与HMGA2在肺鳞癌细胞中的关联。最后,我们用染色体免疫共沉淀的实验方法证实ANG是结合于HMGA2启动子序列,表明ANG对HMGA2的直接调控作用。
【关键词】：血管生成素 肺鳞状细胞癌 高迁移率族蛋白A-2
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 缩略词表11-12
• 前言12-16
• 参考文献14-16
• 第一部分 检测肺鳞癌组织和正常癌旁组织中ANG和HMGA2的表达16-29
• 一、材料和方法16-25
• 二、结果25-27
• 三、讨论27-28
• 参考文献28-29
• 第二部分 ANG及HMGA2的表达在肺鳞癌细胞中的联系及对其功能学的影响29-40
• 一、材料29-31
• 二、方法31-34
• 三、结果34-38
• 参考文献38-40
• 第三部分 ANG通过调控HMGA2诱导肺鳞癌细胞侵袭迁移的机制研究40-50
• 一、材料和方法40-45
• 二、结果与讨论45-48
• 参考文献48-50
• 全文总结50-52
• 综述 肺癌中上皮间质转化的研究进展52-67
• 参考文献60-67
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况67-68
• 致谢68

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