miR-145在肺癌细胞中调控UHRF1并逆转DNA甲基化谱式的改变
本文关键词：miR-145在肺癌细胞中调控UHRF1并逆转DNA甲基化谱式的改变
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【摘要】：在中国,肺癌的预后较差,生存率较低,是最严重的癌症之一。而DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰,被发现在包括肺癌在内的大多数癌症中均是处于异常的状态,比如重复序列的低甲基化和抑癌基因启动子区的高甲基化。在近年的研究中,肿瘤特异的DNA甲基化谱式异常被认为是DNMT1,DNMT3A, DNMT3B和UHRF1的异常高表达所导致的,而且在本研究的数据分析以及肿瘤细胞系和肺癌临床样本的检测中,我们也确实验证了UHRF1/DNMTs在肿瘤中的异常高表达。但现在对于UHRF1/DNMTs在肿瘤中异常高表达的原因还不是非常的清楚。作为一个重要的调控因子,microRNA可能参与了对UHRF1/DNMTs的调控。因此,我们希望能够找到与UHRF1/DNMTs在大多数肿瘤中高表达相关的miRNAs。首先,通过miRNA靶基因预测数据库,我们筛选出预测到的靶向UHRF1/DNMTs的miRNAs,进而通过分析从数据库下载的这些miRNAs在肿瘤中的表达情况,我们筛选出在大多数肿瘤中均是低表达的miRNAs。随后,结合初步的miRNA mimics转染实验和我们检测的这些miRNAs在细胞系和临床样本中的表达情况,我们筛选到了一个肿瘤抑制因子miR-145来进行下一步的实验。经过转染实验,我们发现miR-145能够同时在蛋白水平和mRNA水平抑制UHRF1和DNMT1的表达,而且是通过直接靶向UHRF1的3'-UTR来抑制其表达的。此外,我们发现miR-145能够通过将细胞限制在细胞周期的G1期来抑制细胞的增殖,而且过表达miR-145还能够使A549细胞的整体DNA甲基化水平下降2.8%,同时也降低了除增强子外的大部分基因组元件的DNA甲基化水平。另外,一些抑癌基因(如CDH13, DLC1,RASSF1和CDH1)的启动子区的DNA甲基化水平也会受miR-145的影响而分别有一定程度的下降。有趣的是,我们还发现重复序列LINE1和HERV-K的DNA甲基化水平在miR-145处理后的A549细胞中分别上升了7.9%和7.1%。这些都说明了miR-145能够使肿瘤特异的DNA甲基化谱式得到一定程度的逆转。同时,通过检测细胞系和肺癌临床样本,我们还发现miR-145本身上游启动子区miR-145-promoter及其与miR-143共有的启动子区miR-143/145-promoter在肿瘤细胞中与在正常细胞中相比是处于高甲基化状态的,而且两者的DNA甲基化水平与miR-145的表达有明显的负相关性,其中miR-143/145-promoter更为明显。通过在A549中敲低UHRF1,我们发现UHRF1能够通过影响这两个miR-145启动子区域的DNA甲基化来调控miR-145本身的表达,而且我们发现稳定过表达miR-145的A549细胞中的内源miR-143/145-promoter的DNA甲基化水平明显下降了16.3%,而miR-145-promoter基本没有变化。综上所述,本研究表明miR-145与UHRF1和DNA甲基化之间形成了调控环路,而且它们相互间的调控平衡的异常可能导致了UHRF1的高表达以及肿瘤的发生。
【关键词】：肺癌 DNA甲基化 UHRF1 miR-145
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：
- 摘要6-8
- ABSTRACT8-12
- 第一章 文献综述12-22
- 1 DNA甲基化与癌症12-15
- 1.1 DNA甲基化12-13
- 1.2 DNA甲基化酶系统13
- 1.3 癌症中DNA甲基化的变化13-15
- 1.4 癌症中DNA甲基化酶系统的变化15
- 2 miRNA与DNA甲基化酶系统15-17
- 2.1 miRNA15-17
- 2.2 miRNA对DNA甲基化酶系统的调控17
- 3 miR-145的研究进展17-21
- 3.1 miR-145的定位和调控17-18
- 3.2 miR-145与干细胞分化18-19
- 3.3 miR-145与癌症19-21
- 4 本研究的目的和意义21-22
- 第二章 实验材料与方法22-47
- 1 实验材料22-30
- 1.1 细胞株22
- 1.2 质粒22
- 1.3 抗体22
- 1.4 细菌22
- 1.5 组织样本22-23
- 1.6 实验试剂和试剂盒23-25
- 1.7 实验仪器和耗材25-26
- 1.8 溶液配制26-27
- 1.9 引物序列27-30
- 2 实验方法30-45
- 2.1 细胞培养30
- 2.2 细胞传代30-31
- 2.3 细胞复苏31
- 2.4 细胞冻存31-32
- 2.5 细胞转染32-33
- 2.6 稳定细胞系的构建33-34
- 2.7 质粒构建34-36
- 2.8 总RNA的抽提36
- 2.9 总DNA的抽提36
- 2.10 逆转录反应36-37
- 2.11 实时荧光定量PCR37
- 2.12 流式细胞仪分析细胞周期37-38
- 2.13 双荧光素酶报告基因实验38-39
- 2.14 蛋白免疫印迹(Western Blotting)39-41
- 2.15 细胞增殖实验41-42
- 2.16 简化的有代表性的亚硫酸氢盐测序(RRBS)42-44
- 2.17 亚硫酸氢盐扩增子测序(BSAS)44-45
- 3 数据分析45-47
- 3.1 实验用到的数据库45-46
- 3.2 实验用到的软件46
- 3.3 DNA甲基化水平的分析46-47
- 第三章 实验结果47-65
- 1 DNMTs和UHRF1在肿瘤细胞系和肺癌组织中的高表达47-50
- 2 调控DNMTs/UHRF1的候选miRNA的筛选50-56
- 3 miR-145在肿瘤细胞中对UHRF1和DNMT1的抑制56-59
- 4 miR-145在肿瘤细胞中导致细胞周期停滞和DNA甲基化变化59-62
- 5 miR-145本身受启动子区CpGi的DNA甲基化调控62-65
- 第四章 讨论65-68
- 攻读学位期间待发表论文68-69
- 参考文献69-75
- 致谢75
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，本文编号：559412
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