齐墩果酸诱导人类胃癌细胞自噬性死亡机制的研究

发布时间：2017-08-03 15:33

  本文关键词：齐墩果酸诱导人类胃癌细胞自噬性死亡机制的研究

  更多相关文章： 齐墩果酸 自噬 mTOR 线粒体膜电位 CypD

【摘要】：齐墩果酸(oleanolic acid, OA)是一种植物来源的五环的萜类化合物。广泛分布于自然界药本植物的果实和叶片中。本论文首先通过MTT实验发现,OA对于人类胃癌细胞SGC-7901、MGC-803和BGC-823具有良好的抑制作用。由于之前的报道中,OA对其它癌细胞的抑制作用多通过诱发细胞凋亡。因此实验通过Annexin V-FITC/PI双染和caspase-3活性测定的方法检测OA是否在胃癌细胞中也引起了凋亡。结果证明,OA诱发的胃癌细胞死亡并不通过凋亡途径。凋亡抑制剂z-VAD不能抑制OA引起的胃癌细胞死亡进一步证实了这一点。实验中发现OA诱导了胃癌细胞SGC-7901、MGC-803和BGC823的自噬途径。我们首先检测到OA处理的胃癌细胞中,自噬起始蛋白Beclin-1和自噬体形成蛋白LC3-Ⅱ的表达大量增加。在转染GFP-RFP-LC3质粒的胃癌细胞中,相比空白组细胞, OA处理组可通过共聚焦显微镜检测到大量被GRF和RFP荧光标记的自噬体。进一步通过透射电镜的直接检测,也观察到加药组胃癌细胞中大量自噬体的形成。同时通过自噬抑制剂3-MA和Beclin-1 siRNA阻止OA引发的自噬作用,发现OA引起的细胞死亡也被抑制。因此得出结论,OA对胃癌细胞SGC-7901、MGC-803和BGC823的抑制是通过诱导其自噬性死亡。mTOR是细胞中调控自噬的重要因子,mTOR的磷酸化修饰受到抑制是自噬起始的标志。mTOR在自噬途径中受到PI3K/AKT,ERK/MAPK,AMPK途径的调控。我们在研究中发现OA处理的细胞中,PI3K/AKT,ERK/MAPK途径受到抑制,AMPK途径被激活,这些结果都导致了mTOR的磷酸化受到抑制,并导致自噬的产生。进一步的研究表明,OA也诱导了线粒体膜电位的崩解和ROS升高。而还原剂NAC能降低细胞ROS的水平但不能阻止线粒体膜电位崩解和细胞的自噬,暗示ROS升高可能只是由于线粒体膜电位崩解导致线粒体ROS外泄的结果。我们猜测膜电位的崩解可能与OA诱导的自噬性死亡相关,而线粒体孔道蛋白可能参与了这一过程。而后我们定位到了线粒体孔道蛋白CypD,因为在加入CypD的抑制剂CsA或利用siRNA沉默CypD后,不仅有效的抑制了线粒体膜电位的崩解,并且有效地阻止了OA诱导的细胞自噬和自噬性死亡。因此可认定CypD是OA作用的重要靶位点。本文首次揭示齐墩果酸在胃癌细胞中诱发了自噬性死亡,这条自噬途径是通过抑制PI3K/AKT、ERK/MAPK通路,激活AMPK通路并最终导致mTOR的去磷酸化实现的。而线粒体孔道蛋白CypD是OA一个重要靶位点,OA与CypD作用导致了线粒体膜电位的崩解并最终导致了胃癌细胞自噬性死亡的发生。这项研究为齐墩果酸用于胃癌的治疗提供了重要的理论基础。
【关键词】：齐墩果酸 自噬 mTOR 线粒体膜电位 CypD
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 致谢8-9
• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 第一章 文献综述14-36
• 1 胃癌的现状及防治14-17
• 2 齐墩果酸的生物学活性17-20
• 3 细胞自噬20-26
• 3.1 概述20-21
• 3.2 自噬体的形成21-22
• 3.3 自噬的调控22-23
• 3.4 自噬信号通路23-25
• 3.5 自噬与细胞生存25-26
• 4 线粒体通透性转换孔蛋白26-28
• 4.1 概述26
• 4.2 腺嘌呤核苷酸移位酶26-27
• 4.3 电压依赖性阴离子通道27
• 4.4 亲环素D27
• 4.5 线粒体ATP合酶27
• 4.6 Bax/Bak蛋白27-28
• 5 小结与展望28-30
• 参考文献30-36
• 第二章 齐墩果酸诱导胃癌细胞自噬性死亡实验的材料和方法36-49
• 1 实验材料与试剂36-41
• 1.1 细胞株36
• 1.2 药品36
• 1.3 试剂材料36-38
• 1.4 设备38-39
• 1.5 实验主要试剂配制39-41
• 2 实验方法41-47
• 2.1 细胞的复苏、培养、传代和冻存41-42
• 2.2 MTT法检测细胞活性42
• 2.3 流式细胞术检测细胞凋亡状态42-43
• 2.4 Caspase-3活性检测43-44
• 2.5 Western blot检测细胞内相关蛋白的表达水平44-45
• 2.6 GFP-RFP-LC3质粒的转染45-46
• 2.7 透射电子显微镜观察自噬体46
• 2.8 小RNA干涉实验46
• 2.9 线粒体膜电位的测定46-47
• 2.10 流式细胞仪测定细胞内活性氧(ROS)水平47
• 3 实验数据处理47-48
• 参考文献48-49
• 第三章 齐墩果酸诱导胃癌细胞的自噬性死亡49-70
• 1 齐墩果酸对胃癌细胞的抑制作用49-51
• 2 齐墩果酸未诱导胃癌细胞的凋亡途径51-54
• 2.1 流式细胞术检测齐墩果酸处理后胃癌细胞的凋亡状态51-52
• 2.2 齐墩果酸处理后胃癌细胞Caspase-3活性的检测52-54
• 3 齐墩果酸诱导胃癌细胞自噬的检测54-60
• 3.1 齐墩果酸诱导自噬关键蛋白的上调54-55
• 3.2 激光共聚焦显微镜检查齐墩果酸诱导的细胞自噬55-59
• 3.3 透射电镜观察齐墩果酸处理后胃癌细胞形成的自噬体59-60
• 4 齐墩果酸诱导胃癌细胞的自噬性死亡60-64
• 4.1 Beclin-1 siRNA有效沉默Beclin-1的表达60-61
• 4.2 Beclin-1 siRNA有效抑制齐墩果酸引起的自噬61-62
• 4.3 Beclin-1 siRNA和3-MA有效抑制齐墩果酸对胃癌细胞的毒性62-64
• 5 齐墩果酸诱导胃癌细胞自噬的信号途径64-69
• 参考文献69-70
• 第四章 齐墩果酸通过线粒体膜蛋白CypD介导细胞的自噬性死亡70-86
• 1 齐墩果酸诱导细胞线粒体膜电位降低和ROS升高70-76
• 1.1 齐墩果酸诱导线粒体膜电位降低70-74
• 1.2 齐墩果酸导致胃癌细胞ROS上升74-76
• 2 齐墩果酸通过CypD介导胃癌细胞自噬性死亡76-85
• 2.1 CsA抑制齐墩果酸引起的细胞毒性76-78
• 2.2 CsA抑制齐墩果酸诱导的自噬作用78-81
• 2.3 CypD siRNA能有效沉默CypD的表达81-82
• 2.4 CypD siRNA能有效抑制齐墩果酸引起的细胞毒性82-83
• 2.5 CypD siRNA能有效抑制齐墩果酸引起的细胞自噬83-85
• 参考文献85-86
• 第五章 实验结果与讨论86-92
• 1 结果与讨论86-89
• 2 创新点89-90
• 参考文献90-92
• 中英词汇缩略92-93
• 简历93

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