肾癌细胞中内源性Wnt以自分泌的方式刺激Fzd7的胞吞作用

发布时间：2017-08-09 20:41

  本文关键词：肾癌细胞中内源性Wnt以自分泌的方式刺激Fzd7的胞吞作用

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【摘要】：Wnt蛋白作为分泌型糖蛋白可以结合Fzd受体家族的胞外N-末端半胱氨酸富含区域。在Wnt协同受体存在的条件下,Fzd受体可以应答Wnt蛋白,从而激活经典及非经典信号通路。研究发现,在多种肿瘤中Wnt和Fzd的过表达或者是组成性激活突变基因Fzd的表达与Wnt/β-catenin通路的激活相关。Wnt信号通路参与肾细胞癌(RCC)的形成与发展。Fzd7分子是Fzd受体家族的一员,参与调控细胞的增殖、分化、迁移、组织的极性以及肿瘤的发生、发展等,但对Fzd7在肾透明细胞癌(cc RCC)中的表达研究目前并没有相关报道。此外,现有研究结果表明,在多种肿瘤细胞中,Wnt可以以自分泌机制激活经典以及非经典信号通路,并且Wnt可通过结合膜表面Fzd受体来传导信号通路并被内化。一些研究者发现内化的Wnt-受体复合体可增强Wnt信号通路。另有研究显示,在经典和非经典信号通路中,Wnt配体都可以诱导相应的Fzd受体发生胞吞,且Fzd胞吞或胞内运输所引起的变化对信号通路有一定的影响,这一作用似乎成为经典及非经典信号通路的必要组成成分。但是,对于肾细胞癌中,Wnt信号对Fzd受体的作用及相应机制目前尚未有相关研究。本研究旨在检测cc RCC组织及RCC细胞中Fzd7的表达水平,并以肾癌细胞为研究对象,通过控制Wnt信号的活性,探讨其对Fzd7表达调节的相关机制。本论文主要包括以下两部分内容:一、cc RCC组织、癌旁组织及肾癌细胞中Fzd7的表达水平的检测【目的】检测cc RCC组织、癌旁组织及肾癌细胞中Fzd7的表达水平。【方法】免疫组化检测53例cc RCC组织及相应的癌旁组织中Fzd7的表达,western blot检测三株RCC细胞系786-O、OS-RC-2、Caki-1细胞中Fzd7的表达,并通过内切糖苷酶H和N-糖苷酶F进行去糖基化实验,检测RCC细胞中是否存在糖基化修饰现象。【结果】免疫组化结果显示,约36%的cc RCC组织存在Fzd7的表达,与癌旁组织相比,Fzd7在癌组织中过表达,说明Fzd7在肿瘤发展过程中发挥作用;western blot结果显示,三株RCC细胞中,Fzd7存在多条主条带,包括Fzd7单体64 k D,以及60 k D,35 k D两条条带,内切糖苷酶H和N-糖苷酶F处理对Fzd7在三种RCC细胞中的条带分布无显著影响,说明这三条条带并非Fzd7未成熟的糖基化形式,那么分子量小于64k D的条带很有可能是未完成合成的Fzd7或者是Fzd7胞吞后被降解的条带。【结论】确定了cc RCC组织及RCC细胞中存在Fzd7的表达,为进一步研究RCC细胞中Wnt诱导Fzd7的胞吞作用提供了研究基础。二、内源性Wnt诱导Fzd7的胞吞作用的研究【目的】研究RCC细胞中内源性Wnt信号分子诱导Fzd7受体的胞吞作用。【方法】体外培养RCC细胞系786-O、OS-RC-2、Caki-1细胞,采用RT-PCR和Real-time PCR检测几种经典Wnts的表达;用Wnt分泌抑制剂IWP-2、Clathrin抑制剂氯丙嗪和caveolae抑制剂制霉菌素处理细胞后,western blot检测Fzd7蛋白的变化,以及IWP-2处理后细胞总蛋白中β-catenin和磷酸化β-catenin、细胞浆中β-catenin以及细胞核中β-catenin的变化;Real-time PCR检测RCC细胞中Fzd7的表达水平,通过Fzd7sh RNA、GFPsh RNA转染786-O细胞,并通过Wnt3a处理Fzd7sh RNA/786-O和GFPsh RNA/786-O细胞,MTS分别检测细胞的增殖率。【结果】Western blot结果显示,Wnt分泌抑制剂IWP-2作用于RCC细胞后,可显著增加Fzd7单体64k D条带;Clathrin抑制剂氯丙嗪作用786-O细胞后,Fzd7单体以剂量依赖性的方式增加,而caveolae抑制剂制霉菌素则对Fzd7表达无明显影响,说明内源性Wnt主要通过clathrin介导刺激Fzd7的胞吞作用。不同浓度的IWP-2处理RCC细胞,10u M IWP-2处理后,可显著增加磷酸化β-catenin水平,并降低总β-catenin水平,此外,IWP-2可抑制OS-RC-2细胞中β-catenin的核转移,说明IWP-2可一定程度上抑制经典通路的激活,且可推断RCC细胞中内源性Wnt激活经典通路。Real-time PCR结果显示,786-O细胞中Fzd7 m RNA水平显著高于OS-RC-2以及Caki-1细胞;细胞增殖实验显示,与GFPsh RNA质粒转染相比,Fzd7 sh RNA转染可显著降低786-O细胞的生长速度;Wnt3a处理Fzd7sh RNA/786-O细胞和GFPsh RNA/786-O细胞,可诱导细胞增殖,且Fzd7sh RNA/786-O细胞增殖速度高于GFPsh RNA/786-O细胞,说明Fzd7在肾细胞癌细胞的增殖过程中发挥作用。【结论】RCC细胞中,内源性Wnt激活经典信号通路,诱导Fzd7的胞吞作用,并且这一作用由Clathrin途径参与介导,此外,Fzd7在肾细胞癌细胞的增殖过程中发挥作用。
【关键词】：Fzd7 Wnt β-catenin 肾细胞癌细胞(RCC) 胞吞作用
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-15
• 第一部分 CCRCC组织、癌旁组织及肾细胞癌细胞中FZD7 的表达水平的检测15-24
• 1 材料15-17
• 1.1 主要试剂15-16
• 1.2 主要溶液的配制16
• 1.3 实验仪器16-17
• 1.4 实验组织与细胞17
• 2 实验方法17-19
• 2.1 细胞培养17
• 2.2 免疫组化检测人ccRCC组织和癌旁组织中Fzd7 的表达水平17-18
• 2.3 RCC细胞中Fzd7 蛋白水平的检测18
• 2.4 检测肾癌细胞中Fzd7 是否存在糖基化修饰18-19
• 2.5 统计学分析19
• 3 实验结果19-22
• 3.1 免疫组化检测肾癌组织中Fzd7 表达水平19-21
• 3.2 Western blot检测肾细胞癌细胞中Fdz7 的表达21-22
• 4 讨论22-24
• 第二部分 内源性WNT对FZD7 胞吞作用的调节机制研究24-37
• 1 材料24-26
• 1.1 主要试剂24-25
• 1.2 主要溶液的配置25
• 1.3 实验仪器25-26
• 1.4 引物与质粒26
• 2 实验方法26-32
• 2.1 细胞培养26-27
• 2.2 反转录PCR、real-time PCR检测肾细胞癌细胞中Fzd7、Wnt分子的mRNA水平27-28
• 2.3 Wnt/β-catenin信号通路与Fzd7 相关性的确定28-30
• 2.4 Western blot检测氯丙嗪、制霉菌素对Fzd7 表达的影响30
• 2.5 Fzd7shRNA、GFPshRNA转染 786-O细胞的构建30-31
• 2.6 MTS法检测细胞增殖31-32
• 2.7 统计学分析32
• 3 实验结果32-35
• 3.1 在肾细胞癌细胞中内源性Wnt刺激Fzd7 的胞吞作用32-33
• 3.2 内源性Wnt通过clathrin介导刺激Fzd7 的胞吞作用33
• 3.3 内源性Wnts激活经典信号通路33-34
• 3.4 Fzd7 shRNA转染可抑制肾细胞癌细胞的增殖34-35
• 4 讨论35-37
• 论文总结37-38
• 参考文献38-42
• 综述 FZD7 作为肿瘤潜在治疗靶点的研究42-51
• 参考文献48-51
• 攻读学位期间公开发表的论文51-52
• 中英文缩略词52-53
• 致谢53-54

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